Märkning stamceller med fluorescerande färger för icke-invasiv Detection med optisk avbildning
Summary
Denna video visar tekniker för märkning av mänskliga embryonala stamceller och mesenkymala stamceller med fluorescerande färger. Denna teknik kan användas för en in vivo-spårning av transplanterade stamceller med optisk avbildning och för histopatologisk samband med fluorescensmikroskopi.
Abstract
Optisk avbildning (OI) är ett enkelt, snabbt och billigt verktyg för in vivo-övervakning av nya baserade stamcellsterapi. Tekniken bygger på ex vivo märkning av stamceller med en fluorescerande färg, därefter intravenös injektion av de märkta cellerna och visualisering av deras ackumulering i specifika målorgan eller sjukdomar. De presenterade tekniken visar hur vi märker mänskliga mesenkymala stamceller (hMSC) genom en enkel inkubering med lipofila fluorescerande färg gjorde (C67H103CIN2O3S) och hur vi märker mänskliga embryonala stamceller (hESC) med FDA godkända fluorescerande färg indocyaningrönt (ICG). Upptaget mekanismen är via vidhäftning och spridning av lypophilic färgämnet över fosfolipid cellmembranet tvåskiktsmembran. Märkningen effektiviteten är oftast bättre om cellerna inkuberas med färgen i serum-fria medier i motsats till inkubation i serum innehållande media. Dessutom förbättras tillägg av transfektion agenten protaminsulfat signifikant upptag kontrastmedel.
Protocol
Discussion
OI är en relativt ny bildteknik, som bygger på detektering av fluorescens. OI är lika känslig som radiotracer-baserade avbildningstekniker, men inte associerat med någon bestrålning exponering. OI ger ett effektivt sätt att spåra celler icke-invasivt och upprepade gånger, vilket ger en inblick i cell migration till målsidan. En stor begränsning av tekniken är den begränsade vävnaden penetration av fluorescerande prober in vivo. Således, ett spårämne ackumulering i djupa vävnader, mer än ca 50-10 cm från huden inte kan up…
Acknowledgements
Projektet fick stöd av en Leon J. Thal SEED anslag från California Institute för regenerativ medicin. Tobias Henning har finansierats av ett Research stipendium från den tyska Research Association (DFG, HE 4578/1-2). Vi vill tacksamt erkänna Juanito Meneses för hans råd om odling av mänskliga embryonala stamceller.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Indocyanine Green (IR-125) | Reagent | Fisher Scientific | AC41254-1000 | |
| DMSO | Reagent | Sigma | D-2650 | |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma | G1890 | Dilute to final concentration of 0.1% in PBS |
| PBS, Mg and Ca free | Reagent | GIBCO | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FCS, characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Reagent | BD Falcon | 352340 | |
| DiD | Reagent | Molecular Probes | V-22887 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO | 10828028 | |
| b-Mercaptoethanol | Reagent | Sigma | 7522 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine 200mM | Reagent | GIBCO | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO | 15140-122 | |
| Protamine Sulfate | Reagent | American Pharmaceutical Partners Inc. |
Referências
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Stem cell tracking with Gadophrin-2 — a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).
- Simon, G. H., Daldrup-Link, H. E., Kau, J., Metz, S., Schlegel, J., Piontek, G., Saborowski, O., Demos, S., Duyster, J., Pichler, B. J. Optical imaging of experimental arthritis using allogeneic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe. Eur J Nucl Med & Mol Imaging. 33, 998-1006 (2006).
- Sutton, E., Henning, T., Pichler, B., Bremer, C., Daldrup-Link, H. E. Cell Tracking with Optical imaging. Eur Radiol. 2, 350-357 (2003).
- Funovics, M. A., Alencar, H., Su, H. S., Khazaie, K., Weissleder, R., Mahmood, U. Miniaturized multichannel near infrared endoscope for mouse imaging. Mol Imaging. 2, 350-357 (2003).
