Shrinky - دينك قطرة الشنق : وسيلة بسيطة إلى نموذج الثقافة والأجرام مضغي الشكل
Summary
نعرض طريقة بسيطة وسريعة لتحميل أرقام محددة مسبقا من الخلايا في الآبار وصيانتها microfabricated للتنمية الجسم مضغي الشكل.
Abstract
الهيئات مضغي الشكل (EB) هي مجاميع من الخلايا الجذعية الجنينية. الطريقة الأكثر شيوعا لإنشاء هذه المجاميع هو الأسلوب قطرة شنقا ، نهجا شاقة من pipetting عدد التعسفي من الخلايا في لوحات جيدا. التفاعلات بين الخلايا الجذعية يجبرن على مقربة من بعضها البعض يروج لجيل من EBS. لأن وسائل الإعلام في كل من الآبار والتي يتم تبادلها يدويا كل يوم ، وهذا النهج هو مكثفة يدويا.
وعلاوة على ذلك ، لأن المعايير البيئية بما في ذلك خلية خلية ، والتفاعلات عامل الخلية القابلة للذوبان ، ودرجة الحموضة ، وتوافر الأكسجين ويمكن لحجم المهام EB ، يمكن الحصول عليها من السكان الخلية التقليدية قطرات شنقا حتى عندما تختلف بشكل كبير مثقف في ظل ظروف مماثلة. وقد أظهرت الدراسات الحديثة حقا أن العدد الأولي من الخلايا التي تشكل مجموع يمكن أن يكون لها آثار كبيرة على تمايز الخلايا الجذعية. طورنا طريقة بسيطة الثقافة وسريعة ، وقابلة لتحميل أرقام محددة مسبقا من الخلايا في الآبار وصيانتها microfabricated للتنمية الجسم مضغي الشكل. أخيرا ، فإن هذه الخلايا يمكن الحصول عليها بسهولة لمزيد من التحليل والتجريب. هذه الطريقة هي قابلة لأي مختبر ويتطلب أي معدات متخصصة. نظهر هذا الأسلوب من خلال إنشاء هيئات مضغي الشكل باستخدام الخلايا الحمراء الفلورسنت الماوس سطر (129S6B6 – F1).
Protocol
Discussion
طورنا طريقة بسيطة الثقافة وسريعة ، وقابلة لتحميل أرقام محددة مسبقا من الخلايا في الآبار microfabricated (مصبوب من Dinks – Shrinky) والمحافظة عليها من أجل التنمية الجسم مضغي الشكل. أخيرا ، فإن هذه الخلايا يمكن الحصول عليها بسهولة لمزيد من التحليل والتجريب. هذه الطريقة هي قابلة لأي مختبر ويتطلب…
Acknowledgements
نود أن نشكر CIRM لدعم هذا العمل. وقد تم التبرع بسخاء خط خلية من الدكتور أندراس ناجي في مستشفى ماونت سيناي في تورنتو ، أونتاريو.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A | |
| PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 | |
| Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 | |
| PBS | Reagent | Sigma | P4417 | |
| BMP-4 | Reagent | R and D systems | 314-BP-010 | |
| Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 | |
| KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 | |
| Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 | |
| L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 | |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 | |
| D-mercaptoethanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 | |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon | ESG1106 | |
| Printer | Tool | HP | Laser Jet 2420d | |
| Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 | |
| For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) | ||||
Referências
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).
- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
- Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).
- Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies. J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).
- Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. Controlled differentiation of stem cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).
- Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media. Development. 129, 539-549 (2002).
- Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. J Transl Med. 4, (2006).
