태반에서 조혈 줄기 세포의 분리 및 분석

Summary

우리는 개발하는 동안 중요한 조혈 기관으로 태반을 확인했습니다. 우리는 조혈 줄기 세포 (HSCs)이 생성되는 독특한 microenvironmental 틈새의 태반에서 확장 둘 발견했습니다. 여기, 우리는 마우스 태반에 HSCs의 격리 및 시각화에 필요한 실험 기법을 설명합니다.

Abstract

조혈 줄기 세포 (HSCs)는 자기 갱신과 개인의 일생 동안 혈액 lineages 모든 세포 유형을 생성하는 기능이 있습니다. 모든 HSCs는 수영장 크기가 셀프 갱신 세포 분열에 의해 유지되는 후, 배아 발달 동안 등장. 많은 해부 학적 사이트가 태아의 조혈 동안 참여로 HSC 발전의 과정을 규제 HSCs하고 중요한 발달 사건의 해부 출처를 확인하는 것은 복잡하고 있습니다. 최근, 우리는 HSCs가 (Gekas, 외 2005, 로즈, 외 2008) 생성과 독특한 microenvironmental 틈새에 확장하는 중요한 조혈 기관으로 태반을 확인. 따라서 태반들이 출현 및 초기 확장 중에 HSCs의 중요한 원천입니다.

이 문서에서는, 우리는 E10.5 각각 HSCs의 개시와 태반에서 HSC 수영장의 크기에 최대의 발달 단계에 해당 E12.5 태아, 태반에서 murine의 격리에 대한 해부 기술을 보여줍니다. 또한, 우리는 유동세포계측법 또는 기능 assays에 사용하기 위해 단일 ​​세포 현탁액에 placental 조직의 효소 및 기계적 분리에 대한 최적화된 프로토콜을 제시한다. 우리는 태반의 단일 세포에 대한 사용 중지 collagenase의 사용 HSCs의 충분한 수율을 제공 것으로 나타났습니다. 태반에서 HSC 수율에 영향을 미치는 중요한 요소는 사전에 기계적 분리의 정도, 그리고 효소 치료의 기간입니다.

우리는 또한 정확한 세포 틈새에 immunohistochemistry으로 HSCs을 개발의 시각화를위한 고정 냉동 placental 조직 섹션의 준비를 위해 프로토콜을 제공합니다. 조혈 특정 항원이 파라핀 임베디드 섹션의 준비 기간 동안 보존되지 않습니다, 우리는 정기적으로 placental HSCs과 progenitors을 번역을위한 고정 냉동 섹션을 사용합니다.

Protocol

1. 배아 제거 및 placental 해부 시작하려면, 배아 먼저 임신 댐에서 격리해야합니다. 동물이 승인 절차에 따라 euthanized 있습니다 – 우리 사건에서 우리는 마취 isoflurane의 치사량을 사용하는거야 첫째, 에탄올과 복부를 스프레이하고 가위로 작은 절개를합니다. 복부를 발견하고 복막을 열고 잘라 양손으로 피부를 떠날. 포셉로 자궁 뿔을 선택하고 각 말초 끝에 가…

Discussion

이 프로토콜에서 설명하는 실험 절차는 placental 조직 및 조혈 줄기 및 전구 세포의 분리 및 시각화를위한 수 있습니다. 태아 발달에 걸쳐 태반 및 기타 태아 조혈 장기에 HSCs의 예상 세포 수율과 전화 번호에 대한 포괄적인 요약을 위해 우리는 Gekas, 외를 참조하십시오. 2005. 태반의 개발 HSCs 및 기타 조혈 세포의 지방화에 대한 우리 로즈, 외를 참조하십시오. 2008.

Materials

Materials List:
100mM Glucose
10mM NaN3
15-ml conical tubes (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD)
30% Sucrose Solution
35mm Petri Dishes (BD)
4% Paraformaldehyde
50- m cell filters (Celltrics)
5-ml syringes (BD)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector)
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution
Collagenase type I (Sigma)
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation)
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55
Drierite
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher)
Glucose Oxidase 1000u/ml
Levamisole (Vector)
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ)
Normal Horse Serum (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector)
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+)
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+)
Plastic Slide Box (holds 100 slides)
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable)
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12×75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco)
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher)
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen)
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)