Este vídeo demonstra como manter o crescimento de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) no alimentador livre de células condições e como hESCs contínua passagem de alimentação livre de células condições. Confirmação de CTEh pluripotência cultivadas em alimentador livre de células ao microscópio de imunofluorescência condições também é demonstrada. Parte 2 de 3.
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Artigo de método
De MEFs para Matrigel 2: hESCs Divisão de MEFs para Matrigel
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este vídeo demonstra como crescer células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em fibroblastos de rato embrionárias (MEF), as células de alimentação, como hESCs passagem de placas MEF para alimentação livre de células placas Matrigel.
Protocolo
manutenção CTEh cultura diária
- meios de cultura CTEh deve ser trocada a cada 24 hrs. Do frasco estoque ES mídia armazenada a 4 ° C, retire a quantidade de solução necessária (~ 20ml por 6 bem-prato), coloque em um tubo falcon 50ml, e aquecido a 37 ° C em banho-maria. Uma vez que a mídia está aquecido, adicione bFGF armazenadas a 4 ° C para uma concentração final de 10ng/ml. Coloque o estoque bFGF volta a 4 ° C imediatamente após o uso!
- Remover das placas de 6-bem todos, mas ~ 500μl dos meios de comunicação. Certifique-se de rodar o prato cultura para suspender a remoção de detritos. Verifique se o bFGF nos meios de cultura CTEh é bem misturado e ....
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Discussão
Este vídeo demonstra como hESCs passagem de placas MEF para as placas de alimentação livre de células Matrigel. Note-se que a densidade de colônia em Matrigel é maior do que a densidade de colônias, dividindo usual em MEFs. Imunofluorescência e citometria de fluxo para microscopia ou marcadores CTEh pluripotência, como Oct-4 e SSEA-4, são necessários para confirmar a manutenção de hESCs em um estado indiferenciado em condições de alimentação livre de cultura.
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Agradecimentos
Humana estudos de células-tronco embrionárias no laboratório Teitell são suportados por um Instituto da Califórnia de Medicina Regenerativa (CIRM), as sementes conceder RS1-00313. Agradecemos a membros do Centro de Medicina Regenerativa Broad e Investigação em Células Estaminais na Universidade da Califórnia, especialmente Dr. Amander Clark, Dr. Jerome Zack, e membros do Instituto Broad Stem UCLA Facility núcleo celular para o seu apoio de nossos estudos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Substituto de Soro para Depleção (KSR) | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Aminoácidos Não Essenciais | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| SFB | Reagente | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamina | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagente | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagente | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Colagenase IV | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagente | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicilina / Estreptomicina | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatina | Reagente | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagente | BD Biosciences | 354277 | |
| Anticorpo Oct-4 | Reagente | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| Anti-h/mSSEA-4 conjugado com Fitoc–eritrina, IgG3 de camundongo | Reagente | R&D Systems | FAB1435P | |
| Anticorpo secundário IgG de coelho conjugado com FITC | Reagente | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
Referências
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK.
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Reimpressões e permissões
