अर्ध denaturing डिटर्जेंट - agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा Amyloid एकत्रीकरण के लिए स्क्रीनिंग
Summary
SDD उम्र पता लगाने और कोशिकाओं में पॉलिमर की तरह amyloid के लक्षण वर्णन के लिए एक उपयोगी तकनीक है. यहाँ हम एक अनुकूलन है कि इस तकनीक को बड़े पैमाने पर आवेदन करने के लिए उत्तरदायी बनाता प्रदर्शित करता है.
Abstract
Amyloid एकत्रीकरण कई प्रोटीन misfolding विकृतियों और underlies prions के संक्रामक गुण, स्व – templating प्रोटीन है कि कम जीवों में लाभदायक भूमिका के लिए लगा रहे हैं. जो conformationally हैं के साथ जुड़ा हुआ है Amyloids कुख्यात उनके अविलेयता और संरचनात्मक विविधता के कारण अध्ययन के लिए मुश्किल हो गया है. हालांकि, amyloid आकार और डिटर्जेंट अविलेयता पर आधारित पॉलिमर के संकल्प द्वारा किया गया है संभव बनाया अर्ध denaturing डिटर्जेंट agarose जेल वैद्युतकणसंचलन (SDD उम्र). इस तकनीक का पता लगाने और amyloid गठनात्मक वेरिएंट के लक्षण वर्णन के लिए व्यापक उपयोग के लग रहा है. यहाँ, हम इस तकनीक है कि उपन्यास prions और अन्य amyloidogenic प्रोटीन के लिए स्क्रीन जैसे बड़े पैमाने पर अनुप्रयोगों में इसके उपयोग की सुविधा का एक रूपांतर प्रदर्शित करता है. नई विधि SDD उम्र केशिका हस्तांतरण का उपयोग करता है अधिक से अधिक विश्वसनीयता के लिए और उपयोग में आसानी, और किसी भी आकार जेल समायोजित किया जा करने की अनुमति देता है. इस प्रकार, टैग प्रोटीन की एसडीएस अघुलनशील conformers की उपस्थिति के लिए नमूनों की एक बड़ी संख्या, कक्षों या शुट्ठ प्रोटीन से तैयार संसाधित एक साथ कर सकते हैं.
Protocol
Discussion
पहले SDD उम्र Kryndushkin एट अल द्वारा की सूचना मिली थी 1. एसडीएस प्रतिरोधी परिसरों का अध्ययन [साई +] खमीर में prion, और तब से बड़े पैमाने पर उपयोग में पाया दोनों prion और गैर prion 2-9 समुच्चय का अध्ययन. हालांकि, प्रोटीन के एक agarose जेल में एक झिल्ली निम्नलिखित वैद्युतकणसंचलन स्थानांतरित करने समस्याग्रस्त है, और एक विकृत दाग 5 छवि में परिणाम कर सकते हैं . इसके अतिरिक्त, जलमग्न electroblotting सबसे अधिक इस्तेमाल किया तकनीक जेल के आकार के लिए व्यावहारिक सीमाओं परिचय और इस प्रकार कि संसाधित किया जा सकता नमूनों की संख्या. हम नीचे केशिका 10 स्थानांतरण, एक साधारण प्रक्रिया है जो शुष्क सोख्ता कागज के ढेर का उपयोग करता है के लिए जेल से nitrocellulose झिल्ली प्रोटीन हस्तांतरण के रोजगार से इन समस्याओं को संबोधित किया है. केशिका हस्तांतरण विरूपण रोकता है और बड़े जैल आसानी से संसाधित की अनुमति देता है. वहाँ कुछ बातें SDD उम्र का उपयोग कर से पहले विचार कर रहे हैं. कच्चे नमूने के लिए (जैसे, lysates), विशिष्ट प्रोटीन का immunodetection आवश्यक है. SDD उम्र पूरी तरह से ब्याज की प्रोटीन परिसरों denature नहीं करता है, तो प्रोटीन (ओं) को पता लगाया जा amyloidogenic क्षेत्र के बाहर एक मिलान टैग रखना चाहिए. Lysates आम तौर पर के रूप में वे एक सामान्य एसडीएस पृष्ठ के लिए होगा तैयार कर सकते हैं दो महत्वपूर्ण अंतर के साथ हो. सबसे पहले, वृद्धि हुई देखभाल proteolysis से गिरावट को रोकने के लिए लिया जाना चाहिए. आंशिक रूप से denaturing यहां इस्तेमाल शर्तों proteases निष्क्रिय करने के लिए पर्याप्त नहीं हैं, और भी लक्ष्य प्रोटीन अधिक proteolysis करने के लिए अतिसंवेदनशील बना सकते हैं. कम से कम दो गुना की सिफारिश की एकाग्रता में एक पूरा protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल का प्रयोग करें. दूसरा हीटिंग, नमूने बचा जाना चाहिए. यदि एक monomer सभी नकारात्मक नियंत्रण वांछित है, उदाहरण के लिए पुष्टि करने के लिए कि उच्च आणविक वजन प्रजातियों सहसंयोजक संशोधनों, 95 पर एक 10 मिनट ऊष्मायन ° सी में इस्तेमाल किया जा सकता है, जो सबसे amyloids monomeric प्रोटीन को बहाल होगा करने के लिए कारण नहीं हैं.
Acknowledgements
हम इस प्रोटोकॉल के विकास के साथ सहायता के लिए साइमन Alberti धन्यवाद. यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के (GM25874), हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट (एसएल के लिए) Investigatorship, और एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन predoctoral प्रशिक्षण अनुदान (आरएच करने के लिए) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| zymolyase 100T | Seikagaku America | 120493-1 | ||
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78429 | ||
| Hybond-C extra nitrocellulose | Amersham | RPN303E | ||
| GB004 blotting paper | Whatman | 10427926 | ||
| GB002 (3MM Chr) blotting paper | Whatman | 3030-917 | ||
| Agarose (UltraPure) | Invitrogen | 15510-027 |
References
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