पूरे जीनोम सरणी तुलनात्मक जीनोमिक संकरण के तकनीकी प्रदर्शन
Summary
इस वीडियो के पूरे जीनोम खपरैल का छत पथ सरणी CGH, जो पूरे मानव जीनोम डीएनए कि अभिलेखीय formalin तय सामग्री सहित सूत्रों की एक किस्म से अलग किया जा सकता का केवल 25-100 एनजी का उपयोग कर स्कैन के लिए एक संकरण प्रोटोकॉल के तकनीकी प्रदर्शन है.
Abstract
सरणी तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (सरणी CGH) डीएनए खंडों या 1 जीनोम में जीन खुराक के लाभ और नुकसान का पता लगाने के लिए एक विधि है. इस प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में हाल के अग्रिमों के कैंसर और अन्य आनुवंशिक रोगों 2 में आनुवंशिक परिवर्तन की पहचान के लिए पूरे जीनोम के उच्च संकल्प की तुलना में सक्षम है. संकल्प उप Megabase खपरैल का छत सेट सरणी (या SMRT) सरणी लगभग तीस हजार जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र (बीएसी) क्लोन है कि ~ 100 kilobase जोड़ी में मानव जीनोम (केबी) खंडों 2 अवधि अतिव्यापी का एक सेट शामिल है . ये बीएसी लक्ष्य व्यक्तिगत और संश्लेषित कर रहे हैं एक गिलास स्लाइड 2-4 पर दो प्रतियों में देखा. ऐरे CGH प्रतिस्पर्धी संकरण के सिद्धांत पर आधारित है. संदर्भ और डीएनए नमूना विभिन्न Cyanine-3 के साथ लेबल रहे हैं और Cyanine-5 फ्लोरोसेंट रंजक, और सरणी के लिए सह – संकरित. एक ऊष्मायन अवधि के बाद अनबाउंड नमूने स्लाइड से धो रहे हैं और सरणी imaged है. एक आज़ादी से उपलब्ध कस्टम सॉफ्टवेयर SeeGH (www.flintbox.ca) नामक पैकेज एकत्र डेटा की बड़ी मात्रा प्रक्रिया के लिए प्रयोग किया जाता है – एक ही प्रयोग में 53,892 डेटा बिंदु उत्पन्न. प्रत्येक बीएसी लक्ष्य पर 2 नमूने जो खड़ी गुणसूत्र 5,6 स्थिति के साथ गठबंधन किया है के बीच SeeGH log2 संकेत तीव्रता अनुपात visualizes . SMRT सरणी के रूप में 7 आकार में 50 केबी के रूप में छोटे परिवर्तन का पता लगा सकते हैं. SMRT सरणी डीएनए डीएनए लाभ, हानि, amplifications और homozygous विलोपन सहित पुनर्व्यवस्था घटनाओं की एक किस्म का पता लगा सकते हैं. SMRT सरणी का एक अनूठा लाभ यह है कि एक formalin तय आयल एम्बेडेड नमूनों से पृथक डीएनए का उपयोग कर सकते हैं. जब unamplified डीएनए (25-100ng) के कम इनपुट आवश्यकताओं के साथ संयुक्त इस 7,8 microdissection द्वारा उत्पादित उन के रूप में कीमती नमूनों की रूपरेखा की अनुमति देता है . यह प्रत्येक बीएसी संकरण लक्ष्य है कि पता लगाने के लिए संकेतों का उत्पादन के लिए पर्याप्त लेबल नमूने के बंधन की अनुमति देता है बड़े आकार के लिए जिम्मेदार ठहराया है. इस मंच का एक अन्य लाभ ऊतक विविधता की सहिष्णुता है, थकाऊ ऊतक 8 microdissection के लिए की जरूरत कम है. यह वीडियो प्रोटोकॉल के माध्यम से इनपुट डीएनए लेबलिंग पूरे जीनोम खपरैल का छत पथ SMRT सरणी के लिए अधिग्रहण संकेत से एक कदम दर कदम ट्यूटोरियल है.
Protocol
Discussion
गरीब गुणवत्ता डीएनए एक अच्छा संकरण प्रोफ़ाइल उपलब्ध नहीं कराएगा. यह आवश्यक है कि नमूना सुनिश्चित करने और संदर्भ डीएनए phenol, शाही सेना, नमक, आदि है कि यादृच्छिक प्रधानमंत्री लेबलिंग कदम के साथ संकरण प्रयोग शुरू ?…
Acknowledgements
हम इस लेख की तैयारी के लिए वान Lam लैब बीएसी ऐरे विशेष रूप से Miwa सुजुकी और ब्रायन ची टीम के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं. इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान, जीनोम कनाडा / जीनोम ब्रिटिश कोलंबिया, और NIH / NIDCR अनुदान DE15965 01-RO1 के लिए कनाडा के संस्थानों से धन के द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5X Klenow Buffer | Reagent | Promega | ||
| Random Octamers | Reagent | Alpha DNA | ||
| 10X dNTP mix | Reagent | Promega | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
| Cy-3 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Cy-5 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Human Genomic DNA Reference | Reagent | Novagen | Example of a possible reference | |
| Klenow | Reagent | Promega | ||
| YM-30 Column | Reagent | Millipore | ||
| Cot-1 DNA | Reagent | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Reagent | Roche | ||
| Sheared Herring Sperm DNA | Reagent | Promega | ||
| Coverslip | Reagent | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
| Hybridization Cassette | Tool | Telechem |
Referências
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