Technische demonstratie van Whole Genome Array comparative genomic hybridisatie
Summary
Deze video is een technische demonstratie van de hybridisatie protocol voor hele genoom betegelen pad array CGH, die het hele menselijke genoom met slechts 25 tot 100 ng van DNA kan worden geïsoleerd uit een verscheidenheid aan bronnen, waaronder archiefmateriaal formaline gefixeerd materiaal scans.
Abstract
Array comparative genomic hybridisatie (array CGH) is een methode voor het detecteren van winsten en verliezen van DNA-segmenten of gen dosering in het genoom 1. Recente ontwikkelingen in deze technologie in staat hebben gesteld een hoge resolutie vergelijking van hele genomen voor de identificatie van genetische veranderingen in kanker en andere genetische ziekten 2. De Sub-Megabase Resolution Tegelwerk-set array (of SMRT) array bestaat uit een set van ongeveer dertigduizend overlappende bacteriële kunstmatig chromosoom (BAC) klonen die het menselijk genoom in ~ 100 kilobase pair (kb) segmenten 2 span. Deze BAC targets zijn individueel gesynthetiseerd en gespot in tweevoud op een glasplaatje 2-4. Array CGH is gebaseerd op het principe van concurrerende hybridisatie. Monster en referentie-DNA zijn verschillend gelabeld met Cyanine-3 en Cyanine-5 fluorescerende kleurstoffen, en co-gehybridiseerd aan de array. Na een incubatietijd van de niet-gebonden monsters worden gewassen van de glijbaan en de array is afgebeeld. Een vrij beschikbare aangepaste software pakket genaamd SeeGH (www.flintbox.ca) wordt gebruikt om de grote hoeveelheid gegevens die zijn verzameld proces – een enkel experiment genereert 53.892 data punten. SeeGH visualiseert de log2 signaal intensiteit verhouding tussen de twee monsters bij elke BAC doelgroep die verticaal is uitgelijnd met chromosomale positie van 5,6. De SMRT array kan detecteren veranderingen zo klein zijn als 50 kb in maat 7. De SMRT array kan detecteren een verscheidenheid van DNA herschikking evenementen, waaronder DNA-winsten, verliezen, amplificaties en homozygote deleties. Een uniek voordeel van de SMRT array is dat men kan gebruiken DNA geïsoleerd uit formaline gefixeerd paraffine ingebed monsters. In combinatie met de lage input eisen van onversterkte DNA (25-100ng) dit maakt profilering van kostbare monsters, zoals die geproduceerd door microdissectie 7,8. Dit wordt toegeschreven aan de grote omvang van elke BAC hybridisatie doelgroep die het mogelijk maakt de binding van voldoende gelabelde monsters te produceren signalen voor detectie. Een ander voordeel van dit platform is de tolerantie van weefsel heterogeniteit, het verminderen van de noodzaak voor vervelende weefsel microdissectie 8. Deze video protocol is een stap-voor-stap handleiding van etikettering de input-DNA door middel van de verwerving signaal voor het hele genoom tegels pad SMRT array.
Protocol
Discussion
Slechte kwaliteit DNA zal niet in een goede hybridisatie profiel. Het is essentieel om ervoor te zorgen dat de monster en DNA-vrij zijn van verontreinigingen zoals fenol, RNA, zout, enz. dat kan met de random eerste etikettering stap bemoeien voordat een hybridisatie experiment. Bijvoorbeeld de resuspensie van DNA in Tris – EDTA (TE) in plaats van water is niet aan te raden zo hoog zoutgehalte kan remmen de etikettering reactie. We raden aan het testen van DNA-kwaliteit met behulp van de Nanodrop spectrofotometer om zowel de hoeveelheid DNA…
Acknowledgements
Wij willen de leden van de Wan Lam Lab BAC Array team vooral Miwa Suzuki en Bryan Chi bedanken voor de voorbereiding van dit artikel. Dit werk werd ondersteund met middelen uit de Canadese Institutes for Health Research, Genome Canada / Genome British Columbia, en NIH / NIDCR verlenen RO1 DE15965-01.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5X Klenow Buffer | Reagent | Promega | ||
| Random Octamers | Reagent | Alpha DNA | ||
| 10X dNTP mix | Reagent | Promega | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
| Cy-3 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Cy-5 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Human Genomic DNA Reference | Reagent | Novagen | Example of a possible reference | |
| Klenow | Reagent | Promega | ||
| YM-30 Column | Reagent | Millipore | ||
| Cot-1 DNA | Reagent | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Reagent | Roche | ||
| Sheared Herring Sperm DNA | Reagent | Promega | ||
| Coverslip | Reagent | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
| Hybridization Cassette | Tool | Telechem |
Referências
- Lockwood, W. W., Chari, R., Chi, B., Lam, W. L. Recent advances in array comparative genomic hybridization technologies and their applications in human genetics. European Journal of Human Genetics. 14, 139-1x`48 (2006).
- Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Watson, S. K., deLeeuw, R. J., Chi, B., Coe, B. P., Snijders, A., Albertson, D. G., Pinkel, D., Marra, M. A., Ling, V., MacAulay, C., Lam, W. L. A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome. Nature Genetics. 36, 299-303 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Lam, W. L. Methods for high throughput validation of amplified fragment pools of BAC DNA for constructing high resolution CGH arrays. BMC Genomics. 5, 6 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Horsman, D. E., Squire, J. A., Lam, W. L. Cytogenetically balanced translocations are associated with focal copy number alterations. Human Genetics. 120, 795-805 (2007).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., MacAulay, C., Lam, W. L. SeeGH — a software tool for visualization of whole genome array comparative genomic hybridization data. BMC Bioinformatics. 5, 13 (2004).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., Ng, R. T., MacAulay, C., Lam, W. L. MD-SeeGH: a platform for integrative analysis of multi-dimensional genomic data. BMC Bioinformatics. 9, 243 (2008).
- Coe, B. P., Ylstra, B., Carvalho, B., Meijer, G. A., Macaulay, C., Lam, W. L. Resolving the resolution of array CGH. Genomics. 89, 647-653 (2007).
- Garnis, C., Coe, B. P., Lam, S. L., MacAulay, C., Lam, W. L. High-resolution array CGH increases heterogeneity tolerance in the analysis of clinical samples. Genomics. 85, 790-793 (2005).
