הפגנה טכנית של הכלאה שלמות מערך הגנום הגנום השוואתי
Summary
סרט הווידאו הזה הוא הפגנה טכני של פרוטוקול הכלאה עבור כל ריצוף הגנום נתיב מערך CGH, שסורקת את הגנום האנושי כולו רק באמצעות 25-100 ng של DNA כי ניתן לבודד מתוך מגוון של מקורות, כולל חומר ארכיוני קבוע פורמלין.
Abstract
גנומית השוואתי מערך ההכלאה (מערך CGH) היא שיטה לגילוי הרווחים וההפסדים של מגזרים דנ"א או מינון גנים הגנום 1. ההתקדמות בטכנולוגיה זו אפשרו השוואה ברזולוציה גבוהה של הגנום כולו לזיהוי שינויים גנטיים בסרטן ומחלות גנטיות אחרות 2. תת Megabase ריצוף שנקבע בהחלטה מערך (או SMRT) מערך מורכב של קבוצה של כ 30,000 חופפים כרומוזום בקטריאלי מלאכותי (BAC) שיבוטים כי ההיקף הגנום האנושי בזוג ~ kilobase 100 (KB) 2 קטעים. מטרות אלה BAC מסונתזים בנפרד הבחין בשני עותקים על זכוכית שקופית אחת 2-4. Array CGH מבוססת על העיקרון של הכלאה תחרותי. לדוגמה ו-DNA התייחסות מסומנים באופן דיפרנציאלי עם Cyanine-3 ואת צובעת Cyanine-5 ניאון, ושיתוף הכלאה למערך. לאחר תקופת דגירה הדגימות מאוגד נשטפים משקופית ואת מערך היא הדמיה. חבילת זמין בחינם תוכנות מותאמות אישית בשם SeeGH (www.flintbox.ca) משמש כדי תהליך נפח גדול של נתונים שנאספו – ניסוי אחד מייצר 53,892 נקודות נתונים. SeeGH מדמיין את האות log2 עוצמת היחס בין 2 דגימות בכל מטרה BAC אשר מיושרים אנכית עם עמדת כרומוזומליות 5,6. מערך SMRT יכול לזהות שינויים קטנים כמו 50 KB בגודל 7. מערך SMRT יכול לזהות מגוון של סידור אירועים DNA לרבות רווחים DNA, הפסדים ומחיקות amplifications הומוזיגוטים. יתרון ייחודי של המערך SMRT היא שאף אחד יכול להשתמש DNA שבודד פורמלין דגימות פרפין קבוע מוטבע. בשילוב עם דרישות קלט נמוך של ה-DNA unamplified (25 100ng) זה מאפשר אפיון של דגימות יקרות כמו אלה המיוצרים על ידי microdissection 7,8. זו מיוחסת גודלו של כל יעד הכלאה BAC המאפשר קשירה של דגימות שכותרתו מספיק כדי לייצר אותות לצורך זיהוי. יתרון נוסף של הפלטפורמה הזו היא סובלנות ההטרוגניות של רקמות, הקטנת הצורך microdissection רקמות משעמם 8. זה פרוטוקול וידאו הדרכה צעד אחר צעד מהתווית DNA קלט דרך לאותת הרכישה עבור מערך שלם ריצוף הגנום נתיב SMRT.
Protocol
Discussion
DNA באיכות ירודה לא תספק פרופיל הכלאה טובה. זה חיוני כדי להבטיח כי המדגם ו-DNA הפניה ללא מזהמים כגון פנול, RNA, מלח, וכו 'שעשויים להפריע צעד תיוג אקראי הממשלה לפני תחילת ניסוי הכלאה. לדוגמה resuspension של דנ"א טריס – EDTA (TE) במקום מים אינה מומלצת כמו ריכוז מלח גבוה יכולים לעכב את התגובה תיו…
Acknowledgements
אנו מבקשים להודות לחברי הצוות לאם וואן BAC מעבדה מערך במיוחד Miwa סוזוקי בריאן צ'י להכנת מאמר זה. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מן המכונים הקנדי לבריאות מחקר הגנום קנדה / הגנום קולומביה הבריטית, ו-NIH / NIDCR מענק RO1 DE15965-01.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5X Klenow Buffer | Reagent | Promega | ||
| Random Octamers | Reagent | Alpha DNA | ||
| 10X dNTP mix | Reagent | Promega | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
| Cy-3 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Cy-5 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Human Genomic DNA Reference | Reagent | Novagen | Example of a possible reference | |
| Klenow | Reagent | Promega | ||
| YM-30 Column | Reagent | Millipore | ||
| Cot-1 DNA | Reagent | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Reagent | Roche | ||
| Sheared Herring Sperm DNA | Reagent | Promega | ||
| Coverslip | Reagent | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
| Hybridization Cassette | Tool | Telechem |
Referências
- Lockwood, W. W., Chari, R., Chi, B., Lam, W. L. Recent advances in array comparative genomic hybridization technologies and their applications in human genetics. European Journal of Human Genetics. 14, 139-1x`48 (2006).
- Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Watson, S. K., deLeeuw, R. J., Chi, B., Coe, B. P., Snijders, A., Albertson, D. G., Pinkel, D., Marra, M. A., Ling, V., MacAulay, C., Lam, W. L. A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome. Nature Genetics. 36, 299-303 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Lam, W. L. Methods for high throughput validation of amplified fragment pools of BAC DNA for constructing high resolution CGH arrays. BMC Genomics. 5, 6 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Horsman, D. E., Squire, J. A., Lam, W. L. Cytogenetically balanced translocations are associated with focal copy number alterations. Human Genetics. 120, 795-805 (2007).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., MacAulay, C., Lam, W. L. SeeGH — a software tool for visualization of whole genome array comparative genomic hybridization data. BMC Bioinformatics. 5, 13 (2004).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., Ng, R. T., MacAulay, C., Lam, W. L. MD-SeeGH: a platform for integrative analysis of multi-dimensional genomic data. BMC Bioinformatics. 9, 243 (2008).
- Coe, B. P., Ylstra, B., Carvalho, B., Meijer, G. A., Macaulay, C., Lam, W. L. Resolving the resolution of array CGH. Genomics. 89, 647-653 (2007).
- Garnis, C., Coe, B. P., Lam, S. L., MacAulay, C., Lam, W. L. High-resolution array CGH increases heterogeneity tolerance in the analysis of clinical samples. Genomics. 85, 790-793 (2005).
