Техническая демонстрация полного генома массива Сравнительный геномной гибридизации
Summary
Это видео является техническая демонстрация гибридизации протокол для целого генома плитки путь массив CGH, который сканирует весь геном человека, используя только 25-100 нг ДНК, которые могут быть выделены из различных источников, в том числе архивных фиксированных формалином материал.
Abstract
Массив сравнительной геномной гибридизации (CGH массив) является методом для выявления выгод и потерь от сегменты ДНК или дозы генов в геноме 1. Последние достижения в этой технологии позволили высокое разрешение сравнения целых геномов для идентификации генетических изменений у онкологических и других генетических заболеваний 2. Суб-Megabase Резолюция Черепица набора массива (или SMRT) массив состоит из набора около 30 тысяч перекрытия бактериальные искусственные хромосомы (BAC) клонов, которые охватывают генома человека в ~ 100 пар kilobase (кб) сегментов 2. Эти BAC цели индивидуально синтезированы и с пятнами в двух экземплярах, на одном предметном стекле 2-4. Массив CGH основан на принципе конкурентного гибридизации. Выборка и ссылки ДНК дифференциально помечены цианиновых-3 и цианиновых-5 флуоресцентные красители, и со-гибридизации с массивом. После инкубационного периода, несвязанные образцы отмывали от слайдов и массив образ. В свободном доступе пользовательский пакет программного обеспечения под названием SeeGH (www.flintbox.ca) используется для обработки больших объемов данных, собранных – одного эксперимента генерирует 53 892 точек данных. SeeGH визуализирует интенсивности сигнала log2 соотношение между 2 пробы в каждой целевой концентрации алкоголя в крови которого вертикально с хромосомными позиции 5,6. Массив SMRT может обнаружить изменения как малые, как 50 КБ 7. Массив SMRT может обнаружить различные ДНК перестановки событий, включая ДНК, прибыли, убытки, усилений и гомозиготных делеций. Уникальное преимущество массива SMRT является то, что можно использовать ДНК, выделенной из фиксированных формалином и залитые парафином образцов. В сочетании с низкими требованиями к входу неусиленных ДНК (25-100ng) это позволяет профилирования драгоценных образцов, таких как, производимые микродиссекции 7,8. Это объясняется большой размер каждой целевой BAC гибридизации, который позволяет связывание меченых образцов достаточное для получения сигналов для обнаружения. Еще одним преимуществом этой платформы является толерантность тканей неоднородности, уменьшая необходимость в утомительной микродиссекции ткани 8. Это видео протокол шаг за шагом учебник от маркировки входных ДНК до получения сигнала для целого ряда плитки генома SMRT пути.
Protocol
Discussion
Низкое качество ДНК не будет обеспечивать хороший профиль гибридизации. Важно, чтобы образцов и эталонов ДНК свободными от загрязняющих веществ, таких как фенол, РНК, соль и т.д., которые могут помешать случайные премьер шаг маркировки до начала гибридизации эксперимента. Например ресуспендирова?…
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить членов Ван Лам Лаборатории BAC массива команда особенно Мива Suzuki и Брайан Чи для подготовки этой статьи. Работа выполнена при поддержке за счет средств канадского института исследований в области здравоохранения, Геном Канада / Геном Британской Колумбии, и NIH / NIDCR грант RO1 DE15965-01.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5X Klenow Buffer | Reagent | Promega | ||
| Random Octamers | Reagent | Alpha DNA | ||
| 10X dNTP mix | Reagent | Promega | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
| Cy-3 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Cy-5 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Human Genomic DNA Reference | Reagent | Novagen | Example of a possible reference | |
| Klenow | Reagent | Promega | ||
| YM-30 Column | Reagent | Millipore | ||
| Cot-1 DNA | Reagent | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Reagent | Roche | ||
| Sheared Herring Sperm DNA | Reagent | Promega | ||
| Coverslip | Reagent | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
| Hybridization Cassette | Tool | Telechem |
Referências
- Lockwood, W. W., Chari, R., Chi, B., Lam, W. L. Recent advances in array comparative genomic hybridization technologies and their applications in human genetics. European Journal of Human Genetics. 14, 139-1x`48 (2006).
- Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Watson, S. K., deLeeuw, R. J., Chi, B., Coe, B. P., Snijders, A., Albertson, D. G., Pinkel, D., Marra, M. A., Ling, V., MacAulay, C., Lam, W. L. A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome. Nature Genetics. 36, 299-303 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Lam, W. L. Methods for high throughput validation of amplified fragment pools of BAC DNA for constructing high resolution CGH arrays. BMC Genomics. 5, 6 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Horsman, D. E., Squire, J. A., Lam, W. L. Cytogenetically balanced translocations are associated with focal copy number alterations. Human Genetics. 120, 795-805 (2007).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., MacAulay, C., Lam, W. L. SeeGH — a software tool for visualization of whole genome array comparative genomic hybridization data. BMC Bioinformatics. 5, 13 (2004).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., Ng, R. T., MacAulay, C., Lam, W. L. MD-SeeGH: a platform for integrative analysis of multi-dimensional genomic data. BMC Bioinformatics. 9, 243 (2008).
- Coe, B. P., Ylstra, B., Carvalho, B., Meijer, G. A., Macaulay, C., Lam, W. L. Resolving the resolution of array CGH. Genomics. 89, 647-653 (2007).
- Garnis, C., Coe, B. P., Lam, S. L., MacAulay, C., Lam, W. L. High-resolution array CGH increases heterogeneity tolerance in the analysis of clinical samples. Genomics. 85, 790-793 (2005).
