שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ'יק לשעבר vivo (תרבות חדש)
Summary
וידאו זה מדגים תרבות חדש, שיטה שבאמצעותה הם עוברים חומוס בתרבית מחוץ הביצה עד 24 שעות. שיטה זו מאפשרת ללמוד פיתוח מוקדם (פס פרימיטיביים עד 14 סום.), תקופה המקבילה E7-9 בעכבר. יישומים של טכניקה זו כוללים electroporation, ב הכלאה אימונוהיסטוכימיה באתרו.
Abstract
עובר אפרוח הוא כלי רב ערך במחקר ההתפתחות העוברית המוקדמת. שקיפות, שלה נגישות וקלות מניפולציה, ולהפוך אותו כלי אידיאלי לחקר היווצרות של דפוסים, somite המוח, בצינור העצבי ואת primordia לב. יישומים של התרבות עובר אפרוח כוללים electroporation של בונה DNA או RNA על מנת לנתח את תפקיד הגן, שתלי של גורם גדילה חרוזים מצופים כגון FGFs ו BMPs, כמו גם הר שלם הכלאה אימונוהיסטוכימיה באתרו. סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים בתרבות עובר אפרוח: ראשית, העובר בתוך explanted מלוחים. ואז, העובר מתמקדת טבעת זכוכית. קרום המקיף את העובר הם הרים לאורך קירות של הטבעת. הטבעת ממוקמת כך בצלחת תרבות המכיל מאגר של albumine. המנה תרבות אטום והניחו בתא לח, שבו העובר הוא תרבותי של עד 24 שעות. לבסוף, העובר יוסר הטבעת, קבוע ומעובדים עבור יישומים נוספים. מדריך לפתרון בעיות מוצג גם.
Protocol
Discussion
השיטה תרבות חדשה 2 יכולים לשמש למגוון רחב של יישומים, החל שתלי של גורם גדילה המכיל חרוזים 3, אל הר שלמה הכלאה באתרו כל אימונוהיסטוכימיה הר 4. התרבות במשך 24 שעות מאפשרת ניטור רציף של ההתפתחות העוברית ביישומים כגון ניתוח זמן לשגות תנועת התא 5 או ניטו?…
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מ 'מרגרט Alkek קרן אל RHF.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Robbins Scientific | M1000 | |
| Pyrex dish (2) | Tool | |||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Surgery | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 62082-00 | |
| Fine scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microcapillary tube | Surgery | Sigma | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps |
| Microdissecting knife | Surgery | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Surgery | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
Referências
- Pannett, P. A., Compton, C. A. The cultivation of tissues in saline. Lancet. 206, 381-384 (1924).
- New, D. T. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morph. 3, 326-331 (1955).
- Alvarez, I. S., Araujo, M., Nieto, M. A. Neural induction in whole chick embryo cultures by FGF. Dev. Biol. 199, 42-54 (1998).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen’s node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Fates and migratory routes of primitive streak cells in the chick embryo. Development. 122, 1523-1534 (1996).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protoc. 3, 419-426 (2008).
