عدم تجانس الخلوي للأنسجة المخ يشكل قيدا هاما لدراسة علامات جينية في لونين لأن معظم فحوصات نقص واحد قرار الخلية. الخلايا العصبية عادة ما تختلط مع الخلايا الدبقية وغيرها من المنظمات غير العصبية. ونحن نقدم على بروتوكول لاستخراج وجمع النوى من الخلايا العصبية في الدماغ البشري.
Abstract
الخلايا العصبية في الدماغ البشري تصبح تالية للتفتل بشكل كبير خلال التنمية قبل الولادة ، وبالتالي الحفاظ على النواة طوال العمر الكامل. ومع ذلك ، لا يعرف إلا القليل عن تغييرات في الخلايا العصبية وتنظيم الكروماتين النووي خلال مسيرة التنمية والشيخوخة ، أو في أمراض العصبية المزمنة. ومع ذلك ، حتى الآن فحوصات على الحمض النووي ، ومعظم لونين (عدا الأسماك) قرار عدم خلية واحدة. تحقيقا لهذه الغاية ، وعدم تجانس كبير الخلوي للأنسجة المخ يشكل قيدا كبيرا ، لأن تختلط الشرائح السكانية المختلفة عادة من الخلايا العصبية مع أنواع مختلفة من الخلايا الدبقية وغيرها من المنظمات غير العصبية. وأحد الحلول الممكنة لنمو الخلية من نوع ثقافات محددة ، ولكن معظم خلايا الجهاز العصبي المركزي ، بما في ذلك الخلايا العصبية ، هي فيفو السابقين المستدامة ، في أحسن الأحوال ، لمدة أسابيع قليلة فقط ، وبالتالي سيوفر نموذجا غير مكتمل للآليات العاملة جينية محتملة عبر عمر كامل . هنا ، ونحن نقدم على بروتوكول لاستخراج وتنقية النوى من المجمدة (أبدا الثابتة) في الدماغ بعد الوفاة الإنسان. الأسلوب ينطوي على استخراج النواة في المخزن تحلل ناقص التوتر ، تليها تنبيذ فائق وimmunotagging المضادة للNeuN الأضداد. ثم يتم جمع نوى الخلايا العصبية المسماة بشكل منفصل باستخدام مضان تنشيط الفرز. وينبغي أن تكون هذه الطريقة تنطبق على أي منطقة في الدماغ في مجموعة واسعة من الأنواع ومناسب للدراسات مناعي لونين مع الموقع وتعديلها محددة أضداد هيستون ، وفحوصات الحامض النووي وغيرها.
Protocol
استخراج النوى طرح 250 ملغ من أنسجة المخ بعد الوفاة المجمدة في 5 مخزن تحلل مل 1 في douncer ووضعه على الجليد. لاستقبال نحو 5 ملايين النوى بعد FACS الفرز ، ونحن عادة استخدام أنسجة من 1000 ملغ في كل عينة. <li style=";text-align:right;direction:rt…
Discussion
بروتوكول المقدمة هنا ينبغي أن تكون مفيدة بشكل خاص للدراسات التي تركز على التغيرات اللا جينية للونين العصبية ، وبشكل أعم ، على النمط الظاهري الجزيئي لنواة الخلايا العصبية ، أثناء المرض والشيخوخة النامية ، أو في الحالات العادية عصبية أو نفسية. الأسلوب هو من ميزة خاصة عند عدم تجان…
Acknowledgements
الكتاب نقدر المشورة والدعم الفني المقدم من قبل الدكتور ريتشارد Konz والموظفين في صميم مرفق التدفق الخلوي في كلية طب جامعة ماساتشوستس. كما استخدمت الموارد الأساسية التي تدعمها أبحاث الغدد الصماء السكري DK032520 منح المركز. ويدعم هذا العمل عن طريق المنح المقدمة من المعهد الوطني للصحة العقلية (NIMH) ، والمعهد الوطني لتعاطي المخدرات (النداء) والمعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية.
Materials
Reagents:
1. Lysis Buffer
0.32M
Sucrose
5.47 g
5 mM
CaCl2
250 µl
3 mM
Mg(Acetate)2
150 µl
0.1 mM
EDTA
10 µl
10mM
Tris-HCl, pH8
500 µl
1 mM
DTT
17 µl
0.1%
Triton X-100
50 µl
Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water
2. Sucrose Solution
1.8 M
Sucrose
30.78 g
3 mM
Mg(Acetate)2
150 µl
1 mM
DTT
17 µl
10 mM
Tris-HCl, pH8
500 µl
Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water
3. Dounce buffer
10 mM
Tris
0.242 g
4 mM
MgCl2
0.163 g
1 mM
CaCl2
0.03 g
Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water