L'eterogeneità cellulare del tessuto cerebrale rappresenta una limitazione significativa per lo studio delle marcature epigenetiche della cromatina perché la maggior parte saggi mancanza risoluzione singola cella. I neuroni sono in genere mescolati con glia altri e cellule non neuronali. Forniamo un protocollo per estrarre e raccogliere i nuclei neuronali dal cervello umano.
Neuroni nel cervello umano si postmitotic in gran parte durante lo sviluppo prenatale, e quindi mantenere la loro nuclei per tutta la durata della vita piena. Tuttavia, poco si sa sui cambiamenti neuronali e organizzazione della cromatina nucleare durante il corso dello sviluppo e dell'invecchiamento, o in malattie croniche neuropsichiatrici. Tuttavia, ad oggi i test basati la maggior parte della cromatina e DNA (esclusi quelli di pesci) risoluzione mancanza singola cellula. A tal fine, la notevole eterogeneità cellulare del tessuto cerebrale rappresenta una limitazione significativa, perché di solito diverse sottopopolazioni di neuroni sono mescolati con diversi tipi di cellule gliali e di altre cellule non neuronali. Una possibile soluzione sarebbe far crescere specifiche culture di cellule-tipo, ma la maggior parte delle cellule del SNC, tra cui i neuroni, sono ex vivo sostenibile, nella migliore delle ipotesi, solo per poche settimane e quindi avrebbe fornito un modello incompleto per meccanismi epigenetici potenzialmente operanti in tutto il ciclo di vita completo . Ecco, mettiamo a disposizione un protocollo per estrarre e purificare i nuclei da congelati (non fisso) del cervello umano post-mortem. Il metodo prevede l'estrazione dei nuclei in tampone di lisi ipotonica, seguita da ultracentrifugazione e immunotagging con anticorpi anti-NeuN. Etichettati nuclei neuronali vengono poi raccolti separatamente utilizzando la fluorescenza-attivato ordinamento. Questo metodo dovrebbe essere applicabile a qualsiasi regione del cervello in una vasta gamma di specie e adatto per gli studi di immunoprecipitazione della cromatina con il sito-specifici e modifica-anticorpi anti-istoni, e per la metilazione del DNA ed altri test.
Il protocollo presentato qui dovrebbe essere particolarmente utile per gli studi focalizzati sui cambiamenti epigenetici della cromatina neuronale e, più in generale, sul fenotipo molecolare del nucleo neuronale, durante il normale sviluppo delle malattie e l'invecchiamento, o neurologici o psichiatrici. Il metodo è particolarmente vantaggioso quando l'eterogeneità cellulare del tessuto cerebrale, tra cui i potenziali cambiamenti nei neuroni-to-glia razione durante il corso di invecchiamento oa causa di malattia sono un problema …
Gli autori apprezzano la consulenza e il supporto tecnico fornito dal Dr. Richard Konz e del personale presso l'impianto di base Citometria a flusso presso l'Università del Massachusetts Scuola Medica. Risorse di base sostenuto dalla Endocrinologia Diabetes Research Center di Grant DK032520 sono stati utilizzati anche. Questo lavoro è supportato anche da finanziamenti del National Institute of Mental Health (NIMH), l'Istituto Nazionale di Drug Abuse (NIDA) e il National Institute of Child Health e lo Sviluppo Umano.
Reagents:
1. Lysis Buffer | ||
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0.32M | Sucrose | 5.47 g |
5 mM | CaCl2 | 250 µl |
3 mM | Mg(Acetate)2 | 150 µl |
0.1 mM | EDTA | 10 µl |
10mM | Tris-HCl, pH8 | 500 µl |
1 mM | DTT | 17 µl |
0.1% | Triton X-100 | 50 µl |
Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water |
2. Sucrose Solution | ||
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1.8 M | Sucrose | 30.78 g |
3 mM | Mg(Acetate)2 | 150 µl |
1 mM | DTT | 17 µl |
10 mM | Tris-HCl, pH8 | 500 µl |
Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water |
3. Dounce buffer | ||
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10 mM | Tris | 0.242 g |
4 mM | MgCl2 | 0.163 g |
1 mM | CaCl2 | 0.03 g |
Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water |