인간의 사후 뇌 조직에서 핵의 연결을 격리
Summary
뇌 조직의 세포 이질은 대부분의 assays 단일 셀 해상도 부족하기 때문에 염색질의 epigenetic 자국의 연구에 대한 중요한 제한 포즈. 뉴런은 일반적으로 glia 및 기타 비의 연결을 세포와 혼합된 있습니다. 우리는 인간의 두뇌에서 핵의 연결을 추출하고 수집하는 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
인간 두뇌의 뉴런은 태아 발달 동안 주로 postmitotic되며, 따라서 전체 수명에 걸쳐 그들의 핵을 유지합니다. 그러나, 약간은 개발과 노화 과정 동안의 연결 염색질과 핵 조직의 변화 또는 만성 neuropsychiatric 질병에 대해 잘 알려져 있습니다. 그러나, 대부분의 염색질과 DNA 기반 assays (물고기 이외의) 부족 단세포 해상도를 날짜합니다. 뉴런의 일반적으로 다양한 subpopulations가 glia 및 기타 비의 연결을 세포의 다른 종류의 혼합된 있기 때문에이를 위해, 뇌 조직의 상당한 이질 세포는 상당한 한계를 포즈. 한 가지 가능한 솔루션은 셀 타입의 특정 문화를 성장하는 것이지만, 신경을 포함하여 대부분의 CNS의 세포는, 몇 주 동안, 최고의, 지속 전직 생체내이며, 따라서 잠재적으로 전체 수명에 걸쳐 운영 epigenetic 메커니즘에 대한 불완전한 모델을 제공하는 . 여기, 우리는 냉동 (고정 절대) 인간의 사후 두뇌에서 핵을 추출하고 정화하는 프로토콜을 제공합니다. 방법은 안티 NeuN 항체와 ultracentrifugation 및 immunotagging 다음 hypotonic 용해 버퍼에서 핵의 추출을 포함합니다. 라벨의 연결 핵은 다음 형광 활성화 정렬을 사용하여 별도로 수집하고 있습니다. 이 방법은 인류의 다양한에서 뇌 영역에 적용 및 사이트 및 수정 – 특정 안티 – 히스톤 항체 및 DNA의 methylation과 다른 assays를위한과 염색질의 immunoprecipitation 연구에 적합해야합니다.
Protocol
Discussion
여기에 제시 프로토콜이 더 일반적으로 epigenetic의 연결을 염색질의 변화와에 초점을 맞춘 연구에 특히 유용해야 정상적인 개발과 노화, 또는 신경 또는 정신 질환 중의 연결을 핵의 분자 표현형에. 잠재적인 노화의 과정에서 신경 세포 – 투 – glia의 배급에있는 교대 또는 질병에 의한 포함한 뇌 조직의 세포 이질이 우려 일아르 때 방법은 특히 장점입니다. 예를 들어, 염색질의 immunoprecipitation 기술과 함께 …
Acknowledgements
저자는 매사 추세츠 의과 대학의 대학에서 유동세포계측법 핵심 시설에서 박사 리차드 Konz 직원에서 제공하는 조언 및 기술 지원을 주셔서 감사합니다. 당뇨병 내분비학 연구 센터 부여 DK032520 지원의 핵심 자원도 사용되었습니다. 이 작품은 정신 건강의 국립 연구소 (NIMH), 약물 남용의 국립 연구소 (니다) 및 아동 보건 인간 발달의 국립 연구소에서 기금에 의해 지원됩니다.
Materials
Reagents:
| 1. Lysis Buffer | ||
|---|---|---|
| 0.32M | Sucrose | 5.47 g |
| 5 mM | CaCl2 | 250 µl |
| 3 mM | Mg(Acetate)2 | 150 µl |
| 0.1 mM | EDTA | 10 µl |
| 10mM | Tris-HCl, pH8 | 500 µl |
| 1 mM | DTT | 17 µl |
| 0.1% | Triton X-100 | 50 µl |
| Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water | ||
| 2. Sucrose Solution | ||
|---|---|---|
| 1.8 M | Sucrose | 30.78 g |
| 3 mM | Mg(Acetate)2 | 150 µl |
| 1 mM | DTT | 17 µl |
| 10 mM | Tris-HCl, pH8 | 500 µl |
| Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water | ||
| 3. Dounce buffer | ||
|---|---|---|
| 10 mM | Tris | 0.242 g |
| 4 mM | MgCl2 | 0.163 g |
| 1 mM | CaCl2 | 0.03 g |
| Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water | ||
Referências
- Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons. PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122, 133-143 (2005).
- Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells. Biotechniques. 43, 791-797 (2007).
