A heterogeneidade celular de tecido cerebral representa uma limitação significativa para o estudo de marcas epigenéticas na cromatina porque a maioria dos ensaios falta de resolução única célula. Neurônios são normalmente misturados com glia e outras células não-neuronais. Nós fornecemos um protocolo para extrair e coletar núcleos neuronal do cérebro humano.
Abstract
Neurônios no cérebro humano se tornar pós-mitóticos em grande parte durante o desenvolvimento pré-natal, e assim manter seus núcleos em todo o ciclo de vida completo. No entanto, pouco se sabe sobre as alterações na cromatina nuclear neuronal e na organização durante o curso do desenvolvimento e envelhecimento, ou doença neuropsiquiátrica crônica. No entanto, a data mais cromatina e DNA ensaios com base (que não FISH) a falta de resolução única célula. Para este fim, a uma considerável heterogeneidade celular de tecido cerebral representa uma limitação significativa, porque normalmente várias subpopulações de neurônios são misturados com diferentes tipos de células gliais e outras células não-neuronais. Uma possível solução seria a crescer células tipo culturas específicas, mas a maioria das células do SNC, incluindo os neurônios, são ex vivo sustentável, na melhor das hipóteses, por apenas algumas semanas e assim proporcionaria um modelo incompleto de mecanismos epigenéticos potencialmente operacional em todo o ciclo de vida completo . Aqui, nós fornecemos um protocolo para extrair e purificar a partir de núcleos congelados do cérebro pós-morte (nunca fixo) humana. O método envolve a extração de núcleos em tampão de lise hipotônica, seguido por ultracentrifugação e immunotagging com anti-NeuN anticorpos. Rotulados núcleos neuronais são então recolhidos separadamente usando fluorescência ativado classificação. Este método deve ser aplicável a qualquer região do cérebro em uma ampla gama de espécies e adequado para estudos de imunoprecipitação de cromatina com local e modificação específica anticorpos anti-histonas, e para a metilação do DNA e outros ensaios.
Protocol
Extração de núcleos Colocar 250 mg de tecido congelado cérebro pós-morte em 5 mL de Lise um tampão em um douncer e colocá-lo no gelo. Para receber cerca de 5 milhões núcleos após FACS triagem, geralmente usamos 1000 mg de tecido por amostra. Uma vez que o tecido tem descongelado, Dounce o tecido por 1 minuto enquanto no gelo. Pegue o tecido homogeneizado e colocá-lo em um tubo de ultracentrífuga 15 mL claro. Colocar o tubo em gelo. Tome 9 mL da solução de …
Discussion
O protocolo aqui apresentado deve ser particularmente útil para os estudos focados em mudanças epigenéticas da cromatina neuronal e, mais genericamente, sobre o fenótipo molecular do núcleo neuronal, durante a doença em desenvolvimento e envelhecimento, ou em condições normais neurológicos ou psiquiátricos. O método é uma vantagem particular quando a heterogeneidade celular de tecido do cérebro, incluindo mudanças potenciais no neurônio-glia de-ração durante o curso do envelhecimento ou devido a doenças são uma preocupaç…
Acknowledgements
Os autores agradecem o aconselhamento e apoio técnico fornecido pelo Dr. Richard Konz e pessoal nas instalações Núcleo Citometria de Fluxo na Universidade de Massachusetts Medical School. Recursos suportados pelo núcleo de Endocrinologia Diabetes Research Center Grant DK032520 também foram utilizados. Este trabalho é suportado por concessões do National Institute of Mental Health (NIMH), do Instituto Nacional de Abuso de Drogas (NIDA) e do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano.
Materials
Reagents:
1. Lysis Buffer
0.32M
Sucrose
5.47 g
5 mM
CaCl2
250 µl
3 mM
Mg(Acetate)2
150 µl
0.1 mM
EDTA
10 µl
10mM
Tris-HCl, pH8
500 µl
1 mM
DTT
17 µl
0.1%
Triton X-100
50 µl
Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water
2. Sucrose Solution
1.8 M
Sucrose
30.78 g
3 mM
Mg(Acetate)2
150 µl
1 mM
DTT
17 µl
10 mM
Tris-HCl, pH8
500 µl
Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water
3. Dounce buffer
10 mM
Tris
0.242 g
4 mM
MgCl2
0.163 g
1 mM
CaCl2
0.03 g
Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water