A Behavioral Assay, um die Reaktionsfähigkeit der Zebrafisch zu Änderungen in Lichtintensitäten messen
Summary
Wir entwickelten die Visual-Motor Reaktion auf die Motorleistung von Larven Zebrafisch als Reaktion auf Licht-und absteigende quantifizieren. Wir untersuchten auch Zebrafisch-Mutanten Vision, einschließlich der nicht optokinetischen Reaktion (NRC) Mutanten, die vermutlich völlig blind waren, als von einer anderen Vision-Assay, der optokinetischen Reflex getestet.
Abstract
Die optokinetische Reflex (OKR) ist eine grundlegende visuelle Reflex ausgestellt von den meisten Wirbeltieren und spielt eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung des Auges relativ zum visuellen Szene. Allerdings erfordert die OKR, dass ein Tier bewegte Streifen zu erkennen und es ist möglich, dass Fische, die zu einer OKR weisen scheitern möglicherweise nicht vollständig blind. Ein Zebrafisch-Mutante, die keine optokinetischen Antwort c (NRC) hat keine OKR unter allen Lichtverhältnissen getestet und wurde berichtet, dass völlig blind. Bisher haben wir gezeigt, dass OFF-Ganglienzellen Aktivität in diesen Mutanten können aufgezeichnet werden. Um festzustellen, ob mutierte Fisch ohne OKR wie das NRC-Mutante kann einfach Licht-und absteigende entwickelten wir die visuelle Motor Verhaltens-Assay (VMR) zu erkennen. In diesem Test werden einzelne Zebrafischlarven in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte ermöglicht die gleichzeitige Überwachung von Larven mit einem automatischen Video-Tracking-System gelegt. Der Bewegungsapparat Reaktionen der einzelnen Larve bis 30 Minuten Licht ON und 30 Minuten Licht OFF wurden aufgezeichnet und quantifiziert. WT Fische haben einen kurzen Spike der motorischen Aktivität auf Licht an, wie die Schreckreaktion bekannt, durch die Rückkehr zu niedrigeren als Baseline-Aktivität gefolgt, eine so genannte einfrieren. WT Fische drastisch steigen ihre Bewegungsaktivität unmittelbar nach Lichter ausgeschaltet und erst allmählich (über mehrere Minuten) wieder auf den Ausgangswert Bewegungsaktivität. Das NRC-Mutanten ähnlich reagieren auf Licht OFF als WT Fisch, sondern zeigen einen leichten Rückgang in ihre durchschnittliche Aktivität zu WT Fische verglichen. Motor Aktivität in Reaktion auf Licht ON in nrc Mutanten verzögert und träge. Es ist eine langsame Anstiegszeit des NRC-Mutante Reaktion auf ON zu WT Licht ON Reaktion gegenüber Licht. Die Ergebnisse zeigen, dass nrc Fisch nicht vollständig blind. Da Knochenfischen kann Licht durch nicht-retinalen Gewebe zu erkennen, bestätigt uns, dass die unmittelbare Verhaltensreaktionen auf Lichtintensität Veränderungen intakt Augen benötigen, indem Sie die chokh (chk)-Mutanten, die völlig fehlende Augen von den frühesten Stadien der Entwicklung. In unserem VMR-Assay zeigen die chk-Mutanten keine Schreckreaktion entweder Licht ON oder OFF, die zeigen, dass die seitlichen Augen dieses Verhalten zu vermitteln. Die VMR-Assay hier beschriebenen ergänzt die etablierten OKR-Assay, die nicht getestet ist die Fähigkeit des Zebrafisch-Larven auf Veränderungen in Lichtintensitäten reagieren. Darüber hinaus verleiht die Automatisierung der VMR-Test selbst zu High-Throughput-Screening für Mängel in der Lichtstärke gefahren visuelle Antworten.
Protocol
Discussion
Die experimentellen Verfahren zeigen wir im Film sind alle Vertreter der WT Fisch. Allerdings können diese Experimente analog auf mutierte Fisch sowie (siehe repräsentatives Ergebnis Abschnitt) durchgeführt werden. Wir schlagen vor, Platte WT Fisch und mutierte Fische auf der gleichen Platte in ein Schachbrett Entwurf für eine optimale Kontrolle.
Bei der Verwendung von mutierten Fische auf der gleichen Platte wie WT Fisch sicher, dass Sie aufschreiben, welche Art von Fisch in jeder Vertiefung wurde vergoldet. Hier ist ein Vorsch…
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health Grants EY0081 und 5T32UY07145 und von den Tempelrittern Eye Foundation unterstützt. Jason Rihel ist ein Bristol-Squibb Fellow of the Life Sciences Research Foundation.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Microplate devices | Tool | Whatman | 7701-1651 | |
| Transfer pipetes | Tool | VWR | 202205 | |
| Fish water | Reagent | refer to reference #4 | ||
| Recording chambers (Zebrabox) | Tool | Viewpoint Lifesciences | ||
| Videotrack Software | Tool | Viewpoint Lifesciences |
Referências
- Allwardt, A. B., Lall, B. A., Brockerhoff, S. E. Synapse formation is arrested in retinal photoreceptors of the zebrafish nrc mutant. J Neurosci. 21, 2330-2330 (2001).
- Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R. OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 19126-19126 (2007).
- Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. J Neurosci. 26, 13400-13400 (2006).
- Westerfield, M. . The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , (2000).
