Un test per misurare capacità di risposta comportamentale di Zebrafish a variazioni di intensità di luce
Summary
Abbiamo sviluppato il Visual-Motor risposta per quantificare la potenza del motore di zebrafish larvale in risposta alla luce incrementi e decrementi. Abbiamo anche esaminato visione zebrafish mutanti, tra cui la non optocinetico risposta (NRC) mutanti, che si pensava essere completamente cieco quando testato da un altro saggio di visione, il riflesso optocinetica.
Abstract
Il optocinetico riflesso (okr) è un semplice riflesso visivo esibito dalla maggior parte dei vertebrati e svolge un ruolo importante nello stabilizzare l'occhio rispetto alla scena visiva. Tuttavia, il okr richiede che un animale rilevate delle righe in movimento ed è possibile che i pesci che non riescono a mostrare un okr non può essere completamente cieco. Uno zebrafish mutanti, il no optocinetica risposta c (NRC) non ha okr in qualsiasi condizione di luce testato e stato segnalato per essere completamente cieco. In precedenza, abbiamo dimostrato che OFF-ganglio attività delle cellule possono essere registrati in questi mutanti. Per determinare se il pesce mutante senza okr come il mutante in grado di rilevare incrementi nrc luce semplice e decrementa abbiamo sviluppato l'analisi visiva motore comportamentale (VMR). In questo saggio, le larve di pesce zebra singoli sono posti in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti che consentono il controllo simultaneo di larve utilizzando un sistema automatico di video-tracking system. Le risposte locomotore di ogni larva a 30 minuti di luce ON OFF e 30 minuti di luce sono state registrate e quantificati. Pesce WT hanno un breve picco di attività motoria su luci accese, noto come riflesso di trasalimento, seguito dal ritorno inferiore alle attività di base, chiamato congelare. Pesce WT anche drasticamente aumentare la loro attività locomotoria subito dopo le luci spente e solo gradualmente (nell'arco di diversi minuti) ritorno all'attività di base locomotore. I mutanti NRC rispondono in modo simile alla luce OFF come pesci WT, ma mostrano una leggera riduzione della loro attività media rispetto al pesce WT. Attività motoria in risposta alla luce ON in NRC mutanti è in ritardo e lenta. C'è un tempo di salita lenta della risposta nrc mutante alla luce ON rispetto alla luce WT ON risposta. I risultati indicano che i pesci NRC non sono completamente ciechi. Perché teleostei in grado di rilevare la luce attraverso la non-tessuti della retina, abbiamo confermato che le risposte immediate comportamentali alla luce intensità cambiamenti richiedono occhi intatti utilizzando la (chk) chokh mutanti, che mancano completamente gli occhi fin dai primi stadi dello sviluppo. Nel nostro test VMR, i mutanti chk mostrano alcun risposte di allarme a luce sia ON o OFF, mostrando che gli occhi laterali mediare questo comportamento. Il test VMR descritto qui integra la consolidata okr saggio, che non prova la capacità delle larve di zebrafish per rispondere ai cambiamenti di intensità di luce. Inoltre, l'automazione del test VMR si presta a high-throughput screening per difetti di intensità luminosa guidato risposte visive.
Protocol
Discussion
Le procedure sperimentali mostriamo nel film sono tutti rappresentativi di pesce WT. Tuttavia, questi esperimenti può essere fatto in modo analogo sul pesce mutante così (vedi risultato spaccato rappresentativo). Si consiglia di pesce piatto WT e pesce mutante nello stesso piatto in uno schema a scacchiera ai fini del controllo ottimale.
Quando si utilizza pesce mutante nello stesso piatto di pesce WT assicurarsi di scrivere ciò che tipo di pesce è stato placcato in ciascun pozzetto. Ecco un suggerimento su come tenere traccia d…
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Borse Salute EY0081 e 5T32UY07145 e dalla Fondazione Eye Cavalieri Templari. Jason Rihel è un Squibb Bristol-Fellow del Life Sciences Research Foundation.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Microplate devices | Tool | Whatman | 7701-1651 | |
| Transfer pipetes | Tool | VWR | 202205 | |
| Fish water | Reagent | refer to reference #4 | ||
| Recording chambers (Zebrabox) | Tool | Viewpoint Lifesciences | ||
| Videotrack Software | Tool | Viewpoint Lifesciences |
Referências
- Allwardt, A. B., Lall, B. A., Brockerhoff, S. E. Synapse formation is arrested in retinal photoreceptors of the zebrafish nrc mutant. J Neurosci. 21, 2330-2330 (2001).
- Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R. OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 19126-19126 (2007).
- Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. J Neurosci. 26, 13400-13400 (2006).
- Westerfield, M. . The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , (2000).
