ה-DNA מפוגל immunoprecipitation
Summary
וידאו זה מדגים את פרוטוקול ה-DNA immunoprecipitation מפוגל (MeDIP). MeDIP היא הליך יומיים כי סלקטיבי תמציות שברי DNA מפוגל ממדגם הדנ"א הגנומי באמצעות נוגדנים עם ספציפיות עבור 5-methylcytosine (אנטי 5 MC).
Abstract
זיהוי תבניות מתילציה DNA היא הליך שכיח במחקר של אפיגנטיקה, כמו מתילציה ידוע כבעל השפעה משמעותית על ביטוי גנים, והיא מעורבת עם התפתחות המחלה נורמלית, כמו גם<sup> 1-4</sup>. לפיכך, היכולת להבחין בין דנ"א מפוגל ולא מפוגל DNA חיוני ליצירת פרופילים מתילציה של מחקרים כאלה. מפוגל DNA immunoprecipitation (MeDIP) היא טכניקה יעילה להפקת דנ"א מפוגל ממדגם של עניין<sup> 5-7</sup>. מדגם של ng קטנה כמו 200 של ה-DNA הוא מספיק נוגדנים, או immunoprecipitation (IP), התגובה. DNA הוא sonicated לרסיסים הנעים בגודל 300-1000 bp, והוא מחולק immunoprecipitated (IP) קלט (ב) חלקים. ה-DNA הוא ה-IP לאחר מכן חום מפוגל וטופחו אז עם אנטי 5'mC, המאפשר נוגדן חד שבטי כדי לאגד DNA מפוגל. אחרי זה, חרוזים מגנטי המכיל נוגדנים משני עם זיקה הנוגדן העיקרי מתווספים ו מודגרות. אלה חרוז צמודות נוגדנים תחייב את נוגדן חד שבטי השתמשו בשלב הראשון. ה-DNA מורכב חייב את הנוגדן (DNA מפוגל) מופרד משאר הדנ"א באמצעות מגנט למשוך את מתחמי מתוך פתרון. שוטף באמצעות מספר ה-IP חיץ מבוצעות לאחר מכן להסיר את, הלא מאוגד מפוגל DNA. מפוגל ה-DNA / נוגדן מתחמי מתעכלים אז עם proteinase K לעכל את הנוגדנים ומשאיר רק את ה-DNA מפוגל ללא פגע. הדנ"א הוא מועשר מטוהרים על ידי פנול: מיצוי כלורופורם כדי להסיר את החומר חלבון זירז אז resuspended במים לשימוש מאוחר יותר. טכניקות PCR יכול לשמש כדי לאמת את יעילות ההליך MeDIP על ידי ניתוח מוצרי הגברה של IP ו-IN-DNA עבור אזורים הידועים חוסר וידוע מכילים רצפי מפוגל. הדנ"א מפוגל מטוהרים לאחר מכן ניתן להשתמש עבור מוקד ספציפי (PCR) או הגנום כולו (microarray וסדר) מחקרים מתילציה, והוא שימושי במיוחד כאשר מיושם בשיתוף עם כלי מחקר אחרים, כגון פרופיל גנטי הביטוי הכלאה השוואתי מערך הגנום ( CGH)<sup> 8</sup>. חקירה נוספת לתוך מתילציה DNA יוביל לגילוי מטרות epigenetic חדש, אשר בתורו, עשוי להיות שימושי בפיתוח כלי מחקר חדש טיפולית או פרוגנוסטיים עבור מחלות כגון סרטן המאופיינים DNA מפוגל aberrantly<sup> 2, 4, 9-11</sup>.
Protocol
Discussion
ישנה מודעות הולכת וגוברת של ה-DNA משחק תפקיד משמעותי מתילציה של המחלה, ולכן פיתוח של מבחני למדוד שינוי זה הם הופכים חשובים יותר ויותר 3, 12, 13. הטכניקה MeDIP הוא כלי נוח להקרנה על הגנום כולו, הן לבין מוקד ספציפי ברמה 6, 7. טכניקה זו מספקת תצוגה מהירה של מתילציה רמות ?…
Acknowledgements
אנו מבקשים להודות לחברי בראון לאם מעבדות עבור השתתפותם בביקורת זו וידאו במאמר. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מן המכונים הקנדי לחקר הבריאות מייקל סמית הקרן לחקר בריאות.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Biorupter sonicator | Tool | Diagenode | UCD-200 TM | |
| 1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Outro | Sorenson BioScience | 11510 | |
| ND 3300 Spectrophotometer | Tool | NanoDrop | ||
| Primary Antibody: Anti-5′-methylcytosine mouse mAb | Reagent | CalBiochem | 162 33 D3 | |
| Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Reagent | Invitrogen | 112-01D | |
| Magnetic Tube Rack | Tool | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller | Tool | Labnet International | H5500 | |
| IP Buffer | 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature | |||
| Digestion Buffer | 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl |
Referências
- Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends Genet. 24, 231-237 (2008).
- Lu, Q., et al. Epigenetics, disease, and therapeutic interventions. Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).
- Zilberman, D., Henikoff, S. Genome-wide analysis of DNA methylation patterns. Development. 134, 3959-3965 (2007).
- Feinberg, A. P., Tycko, B. The history of cancer epigenetics. Nature reviews. 4, 143-153 (2004).
- Weber, M., et al. Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome. Nat Genet. 39, 457-466 (2007).
- Weber, M., et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nat Genet. 37, 853-862 (2005).
- Wilson, I. M., et al. Epigenomics: mapping the methylome. Cell Cycle. 5, 155-158 (2006).
- Gazin, C., Wajapeyee, N., Gobeil, S., Virbasius, C. M., Green, M. R. An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing. Nature. 449, 1073-1077 (2007).
- Karpinski, P., Sasiadek, M. M., Blin, N. Aberrant epigenetic patterns in the etiology of gastrointestinal cancers. Journal of applied. 49, 1-10 (2008).
- Maekawa, M., Watanabe, Y. Epigenetics: relations to disease and laboratory findings. Current medicinal chemistry. 14, 2642-2653 (2007).
- Vucic, E. A., Brown, C. J., Lam, W. L. Epigenetics of cancer progression. Pharmacogenomics. 9, 215-234 (2008).
- Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429, 457-463 (2004).
- Jones, P. A., Baylin, S. B. The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat Rev Genet. 3, 415-428 (2002).
- Fraga, M. F., Esteller, M. DNA methylation: a profile of methods and applications. Biotechniques. 33, 632-649 (2002).
