甲基化的DNA免疫沉淀
Summary
这个视频演示的甲基化的DNA免疫（MeDIP）协议。 MeDIP是有选择性地从基因组DNA样本中提取5 – 甲基胞嘧啶甲基化的DNA片段具有特异性抗体（抗- 5 MC）为期两天的过程。
Abstract
识别DNA甲基化模式是表观遗传学的研究的一个常见的程序，作为甲基化是已知的基因表达有显着影响，并与参与的正常发展，以及疾病<sup> 1-4</sup>。因此，能力，区分甲基化的DNA和非甲基化的DNA甲基化谱等研究产生至关重要的。甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）是一个有效的技术甲基化的DNA的提取样本的利益<sup> 5-7</sup>。低至200纳克的DNA样本是足够的抗体或免疫沉淀（IP），反应。 DNA是超声在300-1000 BP大小不等的片段，并划分为免疫沉淀（IP）和输入（IN）部分。 IP DNA随后热变性，然后用反5'mC培养，使单克隆抗体结合甲基化的DNA。在此之后，具有亲和力的抗体二抗磁珠添加，并且孵育。这些珠联抗体结合的单克隆抗体用于第一步。势必抗体复合物（甲基化的DNA）的DNA是分开使用磁铁拉配合物的解决方案，其余的DNA。使用IP缓冲区的几个清洗，然后进行删除未绑定，非甲基化的DNA。甲基化的DNA /抗体复合物，然后用蛋白酶K消化，消化离开只有甲基化的DNA完整的抗体。富集的DNA纯化酚：氯仿抽提去除蛋白质的物质，然后沉淀和再悬浮在水中以备后用。 PCR技术可用于分析知识产权的扩增产物，在已知缺乏的地区，已知含有甲基化序列的DNA，来验证的MeDIP程序的效率。然后可以用于纯化的甲基化的DNA位点特异性（PCR）或全基因组（芯片和测序）甲基化研究，并在结合其他的研究工具，如基因表达谱和阵列比较基因组杂交应用时尤其有用（ CGH）<sup> 8</sup>。到DNA甲基化的进一步调查发现的新的后生目标，这反过来，可能aberrantly甲基化的DNA特征的疾病，如癌症，在发展中国家的新的治疗和预后的研究工具非常有用<sup> 2，4，9-11</sup>。
Protocol
Discussion
有一个日益认识到疾病的DNA甲基化起着重要作用，因此发展的分析来衡量这一修改正在成为越来越重要的3，12，13 。 MeDIP技术是筛选适合的工具，同时在全基因组位点特异性的第6级 ， 7。这种技术提供了一个快速查看和使用数量有限的起始DNA的DNA甲基化水平，为便于比较不同来源之间允许。使用该MeDIP产品的下游应用领域包括各种芯片的全基因组CpG岛寡核苷酸阵列，直接P…
Acknowledgements
我们要感谢布朗和林实验室的成员，他们在参与此视频和文章批判。这项工作是由从加拿大健康研究和迈克尔史密斯健康研究基金会研究院的资金支持。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Biorupter sonicator | Tool | Diagenode | UCD-200 TM | |
| 1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Outro | Sorenson BioScience | 11510 | |
| ND 3300 Spectrophotometer | Tool | NanoDrop | ||
| Primary Antibody: Anti-5′-methylcytosine mouse mAb | Reagent | CalBiochem | 162 33 D3 | |
| Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Reagent | Invitrogen | 112-01D | |
| Magnetic Tube Rack | Tool | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller | Tool | Labnet International | H5500 | |
| IP Buffer | 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature | |||
| Digestion Buffer | 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl |
Referências
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