Immunoprécipitation ADN méthylé
Summary
Cette vidéo montre le protocole pour immunoprécipitation ADN méthylé (MeDIP). MeDIP est une procédure de deux jours qui extrait sélectivement des fragments d'ADN méthylé à partir d'un échantillon d'ADN génomique en utilisant des anticorps avec une spécificité pour la 5-méthylcytosine (anti-5 MC).
Abstract
L'identification de modèles de méthylation d'ADN est une procédure commune à l'étude de l'épigénétique, la méthylation est connu pour avoir des effets significatifs sur l'expression des gènes, et est impliqué dans le développement normal ainsi que les maladies<sup> 1-4</sup>. Ainsi, la capacité à discriminer entre l'ADN méthylé et non méthylés d'ADN est essentielle pour générer des profils de méthylation pour de telles études. Méthylés d'ADN immunoprécipitation (MeDIP) est une technique efficace pour l'extraction de l'ADN méthylé à partir d'un échantillon d'intérêt<sup> 5-7</sup>. Un échantillon d'aussi peu que 200 ng d'ADN est suffisante pour l'anticorps, ou immunoprécipitation (IP), la réaction. L'ADN est traité par ultrasons en fragments d'une taille allant 300-1000 pb, et est divisé en immunoprécipité (IP) et d'entrée (IN) portions. L'ADN IP est ensuite dénaturé à la chaleur et ensuite incubées avec des anti-5'mC, permettant à l'anticorps monoclonal de lier l'ADN méthylé. Après cela, les billes magnétiques contenant un anticorps secondaire ayant une affinité pour l'anticorps primaire sont ajoutés et incubés. Ces anticorps perles liés liera l'anticorps monoclonal utilisé dans la première étape. ADN lié au complexe anticorps (ADN méthylé) est séparé du reste de l'ADN en utilisant un aimant pour tirer les complexes de la solution. Plusieurs lavages à l'aide du tampon IP sont ensuite effectuées pour enlever le non consolidées, non méthylés d'ADN. L'ADN méthylé / anticorps sont ensuite digérés par la protéinase K pour digérer les anticorps ne laissant que l'ADN méthylé intacte. L'ADN est purifié enrichi par le phénol: l'extraction du chloroforme pour éliminer la matière protéique et ensuite précipité et resuspendu dans de l'eau pour une utilisation ultérieure. Les techniques de PCR peut être utilisée pour valider l'efficacité de la procédure MeDIP par l'analyse des produits d'amplification de l'ADN IP et IN pour les régions connues pour manque et connu pour contenir des séquences méthylées. L'ADN purifié méthylées peuvent alors être utilisées pour les locus spécifiques (PCR) ou l'ensemble du génome (biopuces et séquençage) des études de méthylation, et est particulièrement utile lorsqu'il est appliqué en conjonction avec d'autres outils de recherche tels que le profilage d'expression génique et d'hybridation génomique comparative sur microréseau ( CGH)<sup> 8</sup>. Une enquête plus approfondie méthylation de l'ADN va conduire à la découverte de nouvelles cibles épigénétiques, qui à leur tour, peuvent être utiles au développement de nouveaux outils de recherche thérapeutique ou pronostique pour les maladies comme le cancer qui sont caractérisées par l'ADN méthylé aberrante<sup> 2, 4, 9-11</sup>.
Protocol
Discussion
Il ya une conscience croissante de la joue rôle important dans la maladie de méthylation de l'ADN, donc le développement de tests pour mesurer cette modification sont de plus en plus important 3, 12, 13. La technique est un outil MeDIP prête pour le dépistage à la fois l'ensemble du génome et spécifiques de locus niveau 6, 7. Cette technique offre une vue rapide des niveaux de méthylation de l'ADN en utilisant des quantités limitées de démarrage de l'ADN et permet des co…
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les membres de la Brown et laboratoires Lam pour leur participation à la critique de cette vidéo et de l'article. Ce travail a été soutenu par des fonds des Instituts canadiens de recherche en santé et de la Fondation Michael Smith pour la recherche en santé.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Biorupter sonicator | Tool | Diagenode | UCD-200 TM | |
| 1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Outro | Sorenson BioScience | 11510 | |
| ND 3300 Spectrophotometer | Tool | NanoDrop | ||
| Primary Antibody: Anti-5′-methylcytosine mouse mAb | Reagent | CalBiochem | 162 33 D3 | |
| Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Reagent | Invitrogen | 112-01D | |
| Magnetic Tube Rack | Tool | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller | Tool | Labnet International | H5500 | |
| IP Buffer | 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature | |||
| Digestion Buffer | 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl |
Referências
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- Zilberman, D., Henikoff, S. Genome-wide analysis of DNA methylation patterns. Development. 134, 3959-3965 (2007).
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