Immunoprecipitazione DNA metilato
Summary
Questo video dimostra il protocollo di immunoprecipitazione DNA metilato (MeDIP). MeDIP è una procedura di due giorni che estrae selettivamente i frammenti di DNA metilato da un campione di DNA genomico utilizzando anticorpi con specificità per 5-metilcitosina (anti-5 MC).
Abstract
L'identificazione di modelli di metilazione del DNA è una procedura comune nello studio dell'epigenetica, come metilazione è conosciuto per avere effetti significativi sulla espressione genica, ed è impegnato con il normale sviluppo così come la malattia<sup> 1-4</sup>. Così, la capacità di discriminare tra il DNA metilato e non metilato del DNA è essenziale per la generazione di profili di metilazione per tali studi. DNA metilato immunoprecipitazione (MeDIP) è una tecnica efficace per l'estrazione del DNA metilato da un campione di interesse<sup> 5-7</sup>. Un campione di appena 200 ng di DNA è sufficiente per l'anticorpo, o immunoprecipitazione (IP), reazione. Il DNA è sonicato in frammenti di dimensioni variabili da 300-1000 bp, ed è diviso in immunoprecipitati (IP) e ingresso (IN) porzioni. DNA IP viene successivamente calore denaturato e poi incubate con anti-5'mC, permettendo l'anticorpo monoclonale di legare il DNA metilato. Dopo questo, sfere magnetiche che contiene un anticorpo secondario con affinità per l'anticorpo primario sono aggiunti, e si incuba. Queste perline legati anticorpi si legano l'anticorpo monoclonale utilizzato nella prima fase. DNA legato al complesso anticorpale (DNA metilato) è separata dal resto del DNA, utilizzando un magnete per tirare i complessi in soluzione. Numerosi lavaggi utilizzando tampone IP vengono poi eseguite per rimuovere l', non legato non metilato DNA. La metilazione del DNA / anticorpo vengono digeriti con proteinasi K per digerire gli anticorpi lasciando solo il DNA metilato intatto. Il DNA purificato è arricchito da fenolo: estrazione con cloroformio per rimuovere la questione delle proteine e poi precipitare e risospeso in acqua per un uso successivo. Tecniche di PCR può essere utilizzato per convalidare l'efficienza della procedura MeDIP analizzando i prodotti di amplificazione del DNA IN IP e per le regioni noti per mancanza e noti per contenere sequenze metilate. Il DNA purificato metilato può quindi essere utilizzata per locus-specifici (PCR) o genome-wide (microarray e sequenziamento) studi di metilazione, ed è particolarmente utile quando applicato in combinazione con altri strumenti di ricerca quali profili di espressione genica e l'ibridazione genomica comparativa serie ( CGH)<sup> 8</sup>. Ulteriori indagini in metilazione del DNA porterà alla scoperta di nuovi bersagli epigenetici, che a sua volta, può essere utile per lo sviluppo di nuovi strumenti di ricerca terapeutica o prognostici per malattie come il cancro che sono caratterizzati da metilazione aberrante del DNA<sup> 2, 4, 9-11</sup>.
Protocol
Discussion
Vi è una crescente consapevolezza della metilazione del DNA gioca significativo ruolo nella malattia, quindi lo sviluppo di test per misurare questa modifica sono sempre più importanti 3, 12, 13. La tecnica MeDIP è uno strumento suscettibile di screening, sia l'intero genoma e locus specifico livello 6, 7. Questa tecnica fornisce una visione rapida dei livelli di metilazione del DNA utilizzando quantità limitate di partenza del DNA e permette un facile confronto tra le diverse fonti. Applic…
Acknowledgements
Desideriamo ringraziare i membri della Brown e laboratori Lam per la loro partecipazione criticare questo video e articolo. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi degli Istituti canadesi di ricerca sulla salute e la Michael Smith Fondazione per la Ricerca Sanitaria.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Biorupter sonicator | Tool | Diagenode | UCD-200 TM | |
| 1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Outro | Sorenson BioScience | 11510 | |
| ND 3300 Spectrophotometer | Tool | NanoDrop | ||
| Primary Antibody: Anti-5′-methylcytosine mouse mAb | Reagent | CalBiochem | 162 33 D3 | |
| Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Reagent | Invitrogen | 112-01D | |
| Magnetic Tube Rack | Tool | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller | Tool | Labnet International | H5500 | |
| IP Buffer | 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature | |||
| Digestion Buffer | 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl |
Referências
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