メチル化DNA免疫沈降
Summary
このビデオでは、メチル化DNA免疫沈降（MeDIP）のためのプロトコルを示しています。 MeDIPは、選択的に5 – メチルシトシン（抗- 5 MC）のための特異性を有する抗体を用いてゲノムDNAのサンプルからメチル化DNA断片を抽出する二日間の手順です。
Abstract
DNAのメチル化パターンの識別には、メチル化が遺伝子発現に大きな影響を持つことが知られているように、エピジェネティクスの研究では一般的な手順であり、通常の開発だけでなく、病気に関与している<sup> 1月4日</sup>。従って、メチル化DNAと非メチル化DNAとを区別する能力は、そのような研究のためにメチル化プロファイルを生成するために不可欠です。メチル化DNA免疫沈降（MeDIPは）興味のサンプルからのメチル化DNAの抽出のための効率的な手法です。<sup> 5月7日</sup>。 DNAのようにわずか200 ngのサンプルは、抗体、または免疫沈降（IP）、反応に十分です。 DNAは、約300〜1,000 bpからサイズの範囲のフラグメントに超音波処理され、そして免疫沈降（IP）と入力（IN）部分に分かれています。 IPのDNAは、その後、熱変性し、モノクローナル抗体は、メチル化DNAを結合させること、抗5'mCとインキュベートされる。この後、一次抗体に対する親和性を有する二次抗体を含む磁性ビーズを添加し、インキュベートする。これらのビーズにリンクされた抗体は、最初のステップで使用されるモノクローナル抗体をバインドします。抗体複合体（メチル化DNA）に結合したDNA溶液から複合体を引き出すために磁石を使用してDNAの残りの部分から分離されている。 IPバッファを使用して数回の洗浄が結合していない、非メチル化DNAを除去するために実行されます。メチル化DNA /抗体複合体は、唯一のメチル化DNAをそのまま残し抗体を消化するためにプロテイナーゼKで消化されています。蛋白質の物質を除去するためにクロロホルム抽出し、後で使用するために沈殿し、水に再懸濁さ：濃縮されたDNAは、フェノールによって精製する。 PCR技術は、IPの増幅産物を分析することにより、地域の欠如に知られているとメチル化配列を含むように知られているため、DNAのMeDIPの手順の効率性を検証するために使用することができます。精製したメチル化DNAは、遺伝子座特異的（PCR）またはゲノムワイド（マイクロアレイやシーケンシング）メチル化の研究に使用し、そのような遺伝子発現プロファイリングとアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションなどの他の研究ツールと組み合わせて適用する場合に特に有用であることができる（ CGH）<sup> 8</sup>。 DNAメチル化へのさらなる調査は、順番に、異常にメチル化DNAを特徴とする、癌などの疾患の新しい治療や予後の研究ツールの開発に便利だと思われる、新たなエピジェネティックなターゲットの発見につながる<sup> 2、4、9-11</sup>。
Protocol
Discussion
疾患において重要な役割のDNAメチル化の戯曲の認識が広がりつつあります、この修正を測定するアッセイのため、開発は13、12、3重要性を増してきています。 MeDIP技術は、全ゲノムと遺伝子座特異的レベル6、7の両方でのスクリーニングのための従順なツールです。この手法は、DNAを始めるの限られた量を使用してDNAのメチル化レベルの急速なビューを提供し、異なるソース?…
Acknowledgements
我々は、このビデオと記事を批評への参加のためにブラウンとラムラボのメンバーに感謝したい。この作品は、健康研究と健康研究のためのマイケルスミス財団のためのカナダの協会からの資金によって支えられている。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Biorupter sonicator | Tool | Diagenode | UCD-200 TM | |
| 1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Outro | Sorenson BioScience | 11510 | |
| ND 3300 Spectrophotometer | Tool | NanoDrop | ||
| Primary Antibody: Anti-5′-methylcytosine mouse mAb | Reagent | CalBiochem | 162 33 D3 | |
| Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Reagent | Invitrogen | 112-01D | |
| Magnetic Tube Rack | Tool | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller | Tool | Labnet International | H5500 | |
| IP Buffer | 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature | |||
| Digestion Buffer | 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl |
Referências
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