Summary
Este vídeo demonstra o protocolo para imunoprecipitação DNA metilado (MEDIP). MEDIP é um procedimento dois dias que, seletivamente, extratos de fragmentos de DNA metilado partir de uma amostra do DNA genômico utilizando anticorpos com especificidade para 5-metilcitosina (anti-5 mC).
Abstract
A identificação de padrões de metilação do DNA é um procedimento comum no estudo da epigenética, como a metilação é conhecido por ter efeitos significativos sobre a expressão gênica, e está envolvida com desenvolvimento normal, bem como doença<sup> 04/01</sup>. Assim, a capacidade de discriminar entre o DNA metilado e não metilado-DNA é essencial para a geração de perfis de metilação para esses estudos. Metilado DNA imunoprecipitação (MEDIP) é uma técnica eficiente para a extração de DNA metilado partir de uma amostra de interesse<sup> 07/05</sup>. Uma amostra de tão pouco como 200 ng de DNA é suficiente para o anticorpo, ou imunoprecipitação (IP), a reação. DNA é sonicado em fragmentos que variam em tamanho de 300-1000 pb, e está dividido em immunoprecipitated (IP) e de entrada (IN) parcelas. DNA IP é posteriormente calor desnaturado e, em seguida, incubadas com anti-5'mC, permitindo que o anticorpo monoclonal de se ligar DNA metilado. Após isso, esferas magnéticas contendo um anticorpo secundário com afinidade para o anticorpo primário são adicionados e incubados. Estes anticorpos bead-linked ligará o anticorpo monoclonal utilizado na primeira etapa. DNA ligado ao complexo de anticorpos (DNA metilado) é separado do resto do DNA usando um ímã para puxar os complexos de solução. Várias lavagens com tampão IP são, então, realizada para remover o desacoplado, DNA não-metilado. O DNA metilado / anticorpo complexos são então digeridos com proteinase K para digerir os anticorpos, deixando apenas o DNA metilado intacta. O DNA enriquecido é purificado por fenol: clorofórmio extração para remover a matéria de proteínas e, em seguida, precipitado e ressuspenso em água para uso posterior. Técnicas de PCR pode ser usado para validar a eficiência do procedimento MEDIP pela análise dos produtos de amplificação de IP e no DNA das regiões conhecidas por falta e conhecido por conter seqüências metiladas. O DNA purificado metilado pode então ser usada para o locus-específica (PCR) ou genome-wide (microarray e seqüenciamento) Estudos de metilação, e é particularmente útil quando aplicado em conjunto com outras ferramentas de pesquisa, tais como perfil de expressão gênica e hibridização genômica comparativa de matriz ( CGH)<sup> 8</sup>. Uma investigação mais aprofundada para metilação do DNA levará à descoberta de novos alvos epigenéticos, que por sua vez, pode ser útil no desenvolvimento de novas ferramentas de pesquisa terapêutica ou prognóstico para doenças como o câncer que se caracterizam por DNA metilado aberrantemente<sup> 2, 4, 9-11</sup>.
Protocol
Discussion
Há uma consciência crescente do papel significativo desempenha na doença de metilação do DNA, portanto, o desenvolvimento de ensaios para medir esta modificação estão se tornando cada vez mais importante 3, 12, 13. A técnica MEDIP é um instrumento favorável para triagem, tanto do genoma inteiro-o e locus específico de nível 6, 7. Esta técnica oferece uma visão rápida dos níveis de metilação do DNA usando quantidades limitadas de partida DNA e permite comparações fáceis entre d…
Acknowledgements
Queremos agradecer aos membros do Brown e laboratórios Lam pela sua participação na crítica a este vídeo e artigo. Este trabalho foi financiado por fundos do Canadian Institutes for Health Research eo Michael Smith Fundação para a Pesquisa em Saúde.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Biorupter sonicator | Tool | Diagenode | UCD-200 TM | |
| 1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Outro | Sorenson BioScience | 11510 | |
| ND 3300 Spectrophotometer | Tool | NanoDrop | ||
| Primary Antibody: Anti-5′-methylcytosine mouse mAb | Reagent | CalBiochem | 162 33 D3 | |
| Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Reagent | Invitrogen | 112-01D | |
| Magnetic Tube Rack | Tool | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller | Tool | Labnet International | H5500 | |
| IP Buffer | 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature | |||
| Digestion Buffer | 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl |
Referências
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