Inmunoprecipitación de ADN metilado
Summary
Este video muestra el protocolo para la inmunoprecipitación de ADN metilado (MeDIP). MeDIP es un procedimiento de dos días que selectivamente extrae fragmentos de ADN metilado de una muestra de ADN genómico utilizando anticuerpos con especificidad para el 5-metilcitosina (anti-5 MC).
Abstract
La identificación de los patrones de metilación del ADN es un procedimiento común en el estudio de la epigenética, como la metilación se sabe que tiene efectos significativos en la expresión génica, y está involucrado con el desarrollo normal, así como la enfermedad<sup> 4.1</sup>. Por lo tanto, la capacidad de discriminar entre el ADN metilado y no metilado de ADN es esencial para la generación de perfiles de metilación de estos estudios. Inmunoprecipitación de ADN metilado (MeDIP) es una técnica eficiente para la extracción de ADN metilado de una muestra de interés<sup> 5.7</sup>. Una muestra de tan poco como 200 ng de ADN es suficiente para que el anticuerpo, o inmunoprecipitación (IP), la reacción. ADN se somete a sonicación en fragmentos que van desde 300-1000 pb, y se divide en immunoprecipitated (IP) y entrada (IN) porciones. ADN IP posteriormente el calor desnaturalizado y luego incubadas con anticuerpos anti-5'mC, permitiendo que el anticuerpo monoclonal de unirse al ADN metilado. Después de esto, partículas magnéticas que contienen un anticuerpo secundario con afinidad por el anticuerpo primario se agregan y se incuban. Estos anticuerpos de cuentas vinculadas se une al anticuerpo monoclonal que se usa en el primer paso. ADN unido al complejo anticuerpo (ADN metilado) se separa del resto del ADN mediante el uso de un imán para tirar de los complejos de la solución. Varios lavados con buffer de propiedad intelectual se ejecutan después de quitar la consolidados, no ADN metilado. El ADN metilado / anticuerpo se digiere con proteinasa K para digerir los anticuerpos dejando sólo el ADN metilado intacto. El ADN se purifica enriquecido con fenol: cloroformo extracción para eliminar el material de proteína y luego se precipitó y se resuspendió en agua para su uso posterior. Técnicas de PCR se puede utilizar para validar la eficacia del procedimiento MeDIP mediante el análisis de los productos de amplificación de IP y en el ADN de las regiones conocidas de la falta y se sabe que contiene secuencias de metilación. El ADN purificado metilado se puede utilizar para el locus-específica (PCR) o todo el genoma (microarrays y la secuenciación) estudios de metilación, y es particularmente útil cuando se aplica en conjunción con las herramientas de investigación tales como perfiles de expresión genética y la hibridación amplia comparativo del genoma ( CGH)<sup> 8</sup>. La investigación adicional en la metilación del ADN se llevará al descubrimiento de nuevas dianas epigenéticos, que a su vez, puede ser útil en el desarrollo de nuevas herramientas de investigación terapéutica o pronóstico de enfermedades como el cáncer que se caracterizan por ADN aberrantemente metilados<sup> 2, 4, 9-11</sup>.
Protocol
Discussion
Hay una creciente conciencia de los juegos de rol significativo en la enfermedad de la metilación del ADN, por lo tanto el desarrollo de ensayos para medir esta modificación se están convirtiendo cada vez más importante 3, 12, 13. La técnica MeDIP es una herramienta susceptible de cribado, tanto en el de todo el genoma y el lugar específico de nivel 6, 7. Esta técnica proporciona una vista rápida de los niveles de metilación del ADN usando una cantidad limitada de partida de ADN y permite …
Acknowledgements
Queremos agradecer a los miembros de la Brown y laboratorios de Lam por su participación en la crítica de este video y en el artículo. Este trabajo fue financiado por los fondos de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud y la Michael Smith Fundación para la Investigación de la Salud.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Biorupter sonicator | Tool | Diagenode | UCD-200 TM | |
| 1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Outro | Sorenson BioScience | 11510 | |
| ND 3300 Spectrophotometer | Tool | NanoDrop | ||
| Primary Antibody: Anti-5′-methylcytosine mouse mAb | Reagent | CalBiochem | 162 33 D3 | |
| Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Reagent | Invitrogen | 112-01D | |
| Magnetic Tube Rack | Tool | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller | Tool | Labnet International | H5500 | |
| IP Buffer | 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature | |||
| Digestion Buffer | 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl |
Referências
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