Patch Clamp Opname van ionenkanalen Uitgedrukt in Xenopus Eicellen
Summary
Dit is bedoeld als een kennismaking met klem opnemen patch van Xenopus laevis oöcyten. Het omvat vitelline membraan verwijderen, de vorming van een gigaohm afdichting (gigaseal), en de optionele conversie van de patch naar buiten-out topologie.
Abstract
Sinds de ontwikkeling door Sakmann en Neher 1, 2, is de patch clamp worden opgericht als een zeer nuttige techniek voor elektrofysiologische metingen van enkele of meervoudige ion kanalen in cellen. Deze techniek kan worden toegepast op ionkanalen, zowel in hun eigen omgeving en uitgedrukt in heterologe cellen, zoals eicellen geoogst uit de klauwkikker, Xenopus laevis. We beschrijven hier de gevestigde techniek van patch clamp opnames van Xenopus oöcyten. Deze techniek wordt gebruikt om ofwel het meten van de eigenschappen van ionenkanalen uitgedrukt in populaties (macropatch) of individueel (single-channel-opname). We richten ons op technieken om de kwaliteit van de eicel voorbereiding en zegel generatie te maximaliseren. Met alle factoren geoptimaliseerd, deze techniek geeft een kans van een succesvolle afsluiting generatie meer dan 90 procent. Het proces kan verschillend worden geoptimaliseerd door iedere onderzoeker op basis van de factoren die hij of zij vindt het belangrijkste, en presenteren we de aanpak die moet leiden tot het grootste succes in onze handen.
Protocol
Discussion
Er zijn vele parameters van elektrofysiologische opname hier niet besproken. Rig setup, systeem beheer van vliegtuiggeluid, kanaal expressie, en het opnemen van protocollen zijn ook allemaal van cruciaal belang voor een goede experimentele resultaten.
In onze ervaring zijn dit de meest kritische parameters voor het vormen van een betrouwbare zegels: hoge kwaliteit eicellen, het verwijderen van de vitelline membraan snel (aka, 'peeling'), gebruik dan pas getrokken pipetten beschermd tegen stof, glad pipetten, toegepaste posit…
Acknowledgements
Krimpen oplossing recept komt uit het lab van RW Aldrich. Wij bedanken de volgende financierende instanties en stichtingen voor ondersteuning: National Institutes of Health, National Science Foundation, American Heart Association, spierdystrofie Vereniging, de Donald B. en Delia E. Baxter Foundation, het Fonds en de Klingenstein McKnight Endowment for Neuroscience.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Patch Clamp Amplifier & Software | Instrument | HEKA or Axon | EPC-10 | Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B) |
| No. 5 forceps (two pairs) | Tool | Fine Science Tools | ||
| Oocyte shrinking solution | Reagent | Ingredient In mM N-methyl-D-glucamine 220 HEPES 10 MgCl2 1 EGTA 10 Aspartic Acid 220 KCl 2 pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine | ||
| woven mesh | 800 um | Spectrum Laboratories INC | 146481 |
Referências
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. . Single-channel Recording. , (1983).
