Gravação de patch-clamp de canais iônicos Expresso em Oócitos Xenopus
Summary
Este destina-se como uma introdução para o patch clamp de gravação a partir de oócitos Xenopus laevis. Abrange vitelínico remoção da membrana, a formação de um selo gigaohm (gigaseal), ea conversão opcional do patch para a topologia de fora-out.
Abstract
Desde o seu desenvolvimento por Sakmann e Neher 1, 2, o patch clamp se estabeleceu como uma técnica extremamente úteis para a aferição eletrofisiológica de canais de iões simples ou múltiplas nas células. Esta técnica pode ser aplicada a canais iônicos tanto no ambiente de sua nativa e expresso em células heterólogas, como oócitos colhidos o sapo com garras Africano, Xenopus laevis. Aqui, descrevemos a técnica bem estabelecida de gravação de patch-clamp de oócitos Xenopus. Esta técnica é utilizada para medir as propriedades de canais iônicos, expressos quer em populações (macropatch) ou individualmente (single-channel de gravação). Nós nos concentramos em técnicas para maximizar a qualidade da preparação de oócitos e geração de selo. Com todos os fatores otimizados, esta técnica dá uma probabilidade de geração de selo de sucesso mais de 90 por cento. O processo pode ser otimizado de forma diferente por cada pesquisador com base nos fatores que ele ou ela acha mais importante, e nós apresentamos a abordagem que levaram à maior sucesso em nossas mãos.
Protocol
Discussion
Há muitos parâmetros de gravação eletrofisiológico não serão discutidos aqui. Configuração de equipamento, sistema de gestão de ruído, expressão de canais e protocolos de gravação são também essenciais para bons resultados experimentais.
Em nossa experiência, estes são os parâmetros mais críticos para a formação de selos de confiança: oócitos de alta qualidade, a remoção da membrana vitelina rapidamente (aka, "peeling"), use pipetas recém puxado protegido de poeira, pipetas suave, a pressão posi…
Acknowledgements
Receita encolher solução é a partir do laboratório de RW Aldrich. Agradecemos aos seguintes agências de fomento e fundações de apoio: National Institutes of Health, National Science Foundation, a American Heart Association, Associação de Distrofia Muscular, o B. Donald e Delia E. Baxter Foundation, o Fundo Klingenstein e da Fundação McKnight for Neuroscience.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Patch Clamp Amplifier & Software | Instrument | HEKA or Axon | EPC-10 | Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B) |
| No. 5 forceps (two pairs) | Tool | Fine Science Tools | ||
| Oocyte shrinking solution | Reagent | Ingredient In mM N-methyl-D-glucamine 220 HEPES 10 MgCl2 1 EGTA 10 Aspartic Acid 220 KCl 2 pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine | ||
| woven mesh | 800 um | Spectrum Laboratories INC | 146481 |
Referências
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. . Single-channel Recording. , (1983).
