Preparação e manutenção dos neurônios da raiz dorsal Gânglios em culturas Compartmented
Summary
Aqui, descrevemos a técnica de preparação e manutenção de câmaras compartimentada para os neurônios sensoriais cultura do gânglio da raiz dorsal.
Abstract
Neurônios estender os processos axonal que estão longe do corpo celular para inervar tecidos-alvo, onde alvo derivado fatores de crescimento são necessários para a sobrevivência neuronal e na função. Neurotrofinas são especificamente necessárias para manter a sobrevivência e diferenciação de neurônios sensoriais que inervam mas a questão de como esses neurotrofinas-alvo derivado comunicar para o corpo celular dos neurônios que inervam tem sido uma área de pesquisa ativa por mais de 30 anos. O modelo mais comumente aceita de como sinais de neurotrofina chegar ao corpo celular propõe que a sinalização endossomos transportar este sinal retrogradamente ao longo do axônio. A fim de estudar o transporte retrógrado, um sistema de cultura foi originalmente concebido por Robert Campenot, em que os corpos celulares estão isolados de seus axônios. A técnica de preparação destas câmaras compartimentado para recapitula cultura sensorial neurônios a estimulação seletiva dos terminais dos neurônios que ocorre na liberação in vivo de seguir-alvo derivado neurotrofinas. Retrógrada eventos que requerem sinalização de longo alcance microtúbulos transporte retrógrado dependentes têm implicações importantes para o tratamento de doenças neurodegenerativas.
Protocol
Discussion
Neste vídeo, demonstramos como se preparar e manter câmaras compartimentado para uso em neurônios DRG cultura. Feito corretamente, este sistema permite a separação do corpo celular do axônio para estudar mecanismos pelos quais neurotrofinas sinal através axônios longos. Uma vez que não é o isolamento fluídico entre os compartimentos, que permite a estimulação seletiva ou tratamento de um compartimento sem a outros compartimentos sendo afetados. Culturas câmara compartimentada pode suportar outros tipos de células, incluindo n…
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Katharina Cosker e Stephanie Courchesne para discussões úteis.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| collagen | Reagent | BD Biosciences | 354249 | |
| N2-methylcellulose 400CPS | Reagent | Sel-Win Chemicals | ||
| Teflon divider | Outro | Tyler Research | CAMP10 | many other types of dividers are available |
| Pin rake | Tool | Tyler Research | Camp-PR | |
| Grease loader | Tool | Tyler Research | Camp-GLSS | |
| DMEM | Reagent | Fisher | MT10017CV | |
| NGF | Reagent | Peprotech | 450-01 | |
| BDNF | Reagent | Peprotech | 450-02 | |
| High vacuum grease | Reagent | Fisher | 14-635-5D | |
| AraC | Reagent | Sigma | C-1768 | |
| 23 gauge luer stub adapter | Tool | Fisher | 427565 | |
| 90° angle hemostats | Tool | Roboz | RS-7035 |
Referências
- Campenot, R. B. Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites. Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).
- Watson, F. L., et al. Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response. Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).
- Heerssen, H. M., et al. Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons. Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2, 599-605 (2006).
- Park, J. W., et al. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).
- Ure, D. R., et al. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).
