Mikroiniekcja oocytów Xenopus laevis

Mikroiniekcja cytów Opus Lavu, a następnie cienkowarstwowa mikroskopia elektronowa jest doskonałym systemem do badania transportu cytoplazmatycznego nukleoskopii. W tym eksperymencie oocyty są defoliowane kolagenazą, a cyty szóstego etapu są wybierane i umieszczane w naczyniu wielodołkowym. Cyty są następnie mikrowstrzykiwane z substratem importu jądrowego po inkubacji cytów w temperaturze pokojowej, aby umożliwić substratowi wejście do jądra.

Cyty są utrwalane i preparowane. Wypreparowane cyty są osadzone w niskotopliwych arosach, ponownie utrwalone tetratlenkiem osmu, odwodnione i zatopione w żywicy epoksydowej. Próbki osadzone w żywicy epoksydowej są cięte za pomocą ultramikrotomu, a skrawki umieszcza się na miedzianej siatce na próbki.

Po barwieniu skrawki są wizualizowane pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym. Cześć, nazywam się Sarah Cohen i pracuję w laboratorium dr Nellie Pane na Wydziale Zoologii Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej. Nazywam się Shelly Ow, również pochodzę z laboratorium Panta.

Dzisiaj pokażemy Wam procedurę mikroiniekcji Zenap Lavis Cytes. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania importu jądrowego ładunków, takich jak wirusy. Więc zacznijmy.

Aby rozpocząć eksperyment, umieść mały kawałek jajnika Zenap Lavis o długości około dwóch centymetrów w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów zawierającej 20 mililitrów roztworu kolagenazy. Kolagenaza usuwa komórki pęcherzykowe otaczające cyty, a następnie umieszcza probówkę na platformie wytrząsarki i delikatnie wystrzeliwuje z prędkością 100 obr./min przez 30 minut. Ten czas różni się w zależności od różnych partii kolagenazy.

Tak więc po godzinie weź małą próbkę cytów i zbadaj je pod mikroskopem preparacyjnym. Odpowiednio. Pozbawione liści cyty powinny być dobrze oddzielone od siebie. Włóż szklaną igłę do cytu, aby zobaczyć, że łatwo się wsuwa.

Jeśli cyty nie są wystarczająco zdefoliowane, pozostaw je w roztworze kolagenazy i sprawdzaj ponownie co pięć minut. Gdy cyty są wystarczająco rozregulowane, umyj je trzykrotnie modyfikowaną solą fizjologiczną i przenieś na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą MBS i 1% streptomycynę penicyliny. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego wybierz dojrzałe cyty w stadium szóstym do mikroiniekcji.

Cyty te są duże z dobrym kontrastem między czarną półkulą zwierzęcą a kremową półkulą roślinną. Przenieś dojrzałe sześć cytów do naczynia wielodołkowego. Aby to zrobić, użyj pipetera o pojemności 200 mikrolitrów z końcówką pipety, która została przecięta na końcu, aby umożliwić niezakłócone ssanie oocytów i ostrożnie przenieś oocyty do wielostudzienki.

Używamy naczynia bez mikrostudzienki z dołkiem o objętości 10 mikrolitrów, miejsca EO są teraz gotowe do mikroiniekcji. Przygotować importowany substrat do mikroiniekcji, dodając jeden mikrolitr 1% błękitu fenolowego brom do 10 mikrolitrów substratu. Niebieski barwnik brom fol dodaje wizualizację mikroiniekcji.

Następnie umieść mały pasek paraform na szalce Petriego o średnicy 100 milimetrów i dozuj pięciolitrową kroplę roztworu do wstrzykiwań na pasek param. Następnie należy uzyskać igłę do wstrzykiwań, pociągając za mikropipetę Drummond o pojemności 6,6 mikrolitra za pomocą wstrzykiwacza oraz ściągacza Matt Puller Skalibruj igłę do wstrzykiwań, wykonując kropki na igle co 0,5 milimetra, co odpowiada objętości 50 nanolitrów. Ustawić mikrowtryskiwacz w tryb aspiracji i napełnić igłę roztworem do wstrzykiwań cytoplazmatycznych.

Włóż końcówkę igły do cytu w półkuli roślinnej, bardzo blisko półkuli zwierzęcej pod kątem około 45 stopni. Następnie ustaw mikrowtryskiwacz na mikro wstrzyknięcie i mikro wstrzyknij każdemu cytowi 50 nanolitrów importowanego substratu. Należy zwracać uwagę na kropki na igle, aby monitorować ilość substratu, który został wstrzyknięty po zakończeniu wstrzyknięć.

Przenieś cyty na 35-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną MBS. Inkubuj cyty w temperaturze pokojowej przez żądany czas. Wybierz punkty czasowe, które pozwalają na obserwację importowanego substratu związanego z kompleksami ubogimi jądrowo lub NPC.

Zazwyczaj używamy punktów czasowych od 10 do 30 minut dla białek i wirusów, które są aktywnie transportowane w kierunku NPC. Te punkty czasowe zależą również od miejsca wstrzyknięcia i wielkości białka wirusa. Po zakończeniu inkubacji przenieś cyty do czteromililitrowej szklanej fiolki zawierającej 2% aldehydu glutarowego w MBS i ustal przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza następnego dnia, umyj cyty trzykrotnie MBS, jesteśmy teraz gotowi do sekcji cytów.

Przenieś cyty na małą szalkę Petriego wypełnioną buforem o niskiej zawartości soli. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego i pęsety preparacyjnej usuń słupek warzywny z każdego oocytu. Przydatne jest ustabilizowanie oocytu za pomocą jednej pary pęsety, podczas gdy druga para jest używana jak nożyczki do usunięcia bieguna roślinnego, ten etap preparacji znacznie ułatwia znalezienie jądra podczas przycinania i cięcia próbek do mikroskopii elektronowej.

W tym momencie obecność niebieskiego odcienia w cytozolu wskazuje na udane mikrowstrzyknięcie odrzucające cyty, które nie zostały pomyślnie mikrowstrzyknięte. Następnie ponownie przymocuj wypreparowane cyty 2% aldehydem glutarowym w LSB przez godzinę w temperaturze pokojowej po utrwaleniu, umyj wycięte cyty trzykrotnie LSB. Po umyciu cytów jesteśmy gotowi do przygotowania wstrzykniętych oocytów do osadzenia i cienkiego przekroju.

Przenieś wypreparowane oocyty do szkiełka depresyjnego, odessaj jak najwięcej płynu, a następnie działaj szybko, aby nie wyschły. Przykryj wypreparowane cyty 2% niskotopliwym arosem, gdy aros jest jeszcze miękki. Użyj końcówki pipety, aby oddzielić cyty od siebie i upewnić się, że każdy cyt jest skierowany do góry lub do dołu, ale nie na boki.

Pozwól agros zestalać się przez około 10 minut. Gdy agros stwardnieje, użyj żyletki, aby pokroić aros na małe kawałki, z których każdy zawiera jeden wycięty cyt. Następnie umieść cyty osadzone w aros w czteromililitrowej szklanej fiolce i za pomocą obrotowego słupka miksera utrwal je 1% tetratlenkiem osmu w LSB na godzinę w temperaturze pokojowej.

Po utrwaleniu przez godzinę, w razie potrzeby umyj próbkę trzykrotnie w LSB. Przechowuj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc i kontynuuj protokół następnego dnia. Sekwencyjnie odwadniaj próbki w 50%70% i 90% etanolu przez 20 minut każda, a następnie odwadniaj dwa razy w 100% etanolu przez 15 minut każda.

Na koniec odwodnić próbki 100% acetonem przez 15 minut po zakończeniu etapów odwadniania. Infiltrować próbki mieszaniną eponu, fluy i acetonu jeden do jednego przez jedną godzinę, następnie infiltrować mieszaniną eponu i acetonu dwa do jednego przez dwie godziny, a na koniec w czystym eponie przez co najmniej sześć godzin. Po zakończeniu ostatniego etapu infiltracji umieść próbki w płaskich foremkach do zatapiania wypełnionych świeżym, czystym eponem.

Ustawić cyty tak, aby strona jądra bliższa miejscu wstrzyknięcia została przecięta. Pierwszy. W takim przypadku strona cytów, która została wypreparowana, zostanie przecięta. Po pierwsze, ten krok optymalizuje szansę na wizualizację importu wybranego podłoża.

Gdy cyty są odpowiednio zorientowane, polimeryzuj epon przez dwa dni w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Po etapie polimeryzacji należy uzyskać odcinki o grubości 50 nanometrów próbek osadzonych w żywicy epoksydowej za pomocą ultramikrotomu. Zbierz skrawki na siatce próbki miedzi, wybarwij próbki i zwizualizuj je pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym.

Jeśli protokół się powiódł, to otoczka jądrowa i NPC powinny być wyraźnie widoczne na mikrofotografiach. W zależności od wstrzykniętego substratu i czasu między wstrzyknięciem a utrwaleniem, substrat powinien być widoczny na cytoplazmatycznej powierzchni NPC w NPC lub na powierzchni jądrowej NPC. Ten reprezentatywny wynik pokazuje przekrój otoczki jądrowej z przylegającą cytoplazmą i jądrem z cytu zenap, któremu wstrzyknięto kapsydy wirusa vao.

Groty strzałek A-C-M-N-P-V wskazują na NPC, a kapsyd dokujący do cytoplazmatycznej powierzchni NPC jest oznaczony białą strzałką. W przeciwieństwie do tego, rysunek ten pokazuje przekrój poprzeczny otoczki jądrowej z sąsiednią cytoplazmą i jądrem z oocytu zenap, któremu wstrzyknięto wirusa parvo myszy. Korzystając z tej techniki, odkryliśmy, że MVM indukuje zakłócenia otoczki jądrowej.

Nawiasy wskazują przerwy w otoczce jądrowej. Groty strzałek wskazują na NPC, a domniemane kapsydy MVM związane z otoczką jądrową są oznaczone białymi strzałkami. Właśnie pokazaliśmy, jak mikrowstrzykiwać i preparować cyty xap levu.

Wykonując tę procedurę, należy pamiętać, że różne partie kolagenazy różnią się od siebie. Dlatego dokładnie przetestuj swoją kolagenazę, aby określić optymalny czas na defoliację. Ponadto, po etapie defoliacji i mycia MBS, cyty mogą być przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia przed mikroiniekcją.

Wreszcie, zawsze trzymaj pośladki w całości, aby ukryć się na lodzie i nigdy nie pozwól, aby osis wyschł. Powinny być całkowicie zanurzone podczas wszystkich etapów odwadniania i infiltracji. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.