Geração de Single-Cell Tissue Suspensões de rato Neural

Dentro do sistema nervoso. Centenas de tipos de células gliais neuronais foram descritos. Cada tipo específico de célula no cérebro ou na medula espinhal tem um repertório de moléculas de superfície celular ou determinantes moleculares através dos quais pode ser identificado e caracterizado.

Atualmente, tecnologias robustas de identificação e separação de células exigem que preparações de células únicas sejam geradas, ao mesmo tempo em que limitam a morte celular e a destruição de proteínas de superfície características. O associador máximo suave, quando usado em combinação com kits de dissociação à base de tripsina ou pepane, pode dissociar o tecido cerebral de forma eficaz e suave, preservando os epítopos do antígeno para limitar a perda celular. Uma vez geradas, as suspensões de células únicas podem ser tratadas com conjugados monoclonais como microesferas anti-proeminentes, que identificam neuroprogenitores ou purificadas ainda mais usando esferas de remoção de mielina.

Olá, meu nome é Sandra PeNAT. Sou gerente de projetos de produtos de neurociência na Mil Biotech aqui na bagagem, Gabert, Alemanha. Hoje vou mostrar como preparar uma suspensão de célula única a partir de tecido cerebral de camundongo usando o desassociador genix.

O desassociador genix é um dispositivo que pode dissociar uma variedade de tipos de tecidos em um ambiente estéril fechado e, portanto, elimina a necessidade de dissociação mecânica manual tediosa. Então vamos começar. Dependendo do epítopo do antígeno de interesse em aplicações subsequentes, use o kit de dissociação do tecido neural à base de papaína ou o kit de dissociação do tecido neural à base de tripsina.

Para o experimento de hoje, preferimos o kit de dissociação de tecido neuro P, pois gostaríamos de isolar células positivas proeminentes usando microesferas anti-proeminentes. O proeminente não é sensível ao pepano nem à tripsina e, nesse caso, o kit de dissociação de tecidos neurológicos P é a melhor escolha. Antes de iniciar o protocolo, os reagentes e soluções devem ser preparados para este kit.

Tenha em mãos seu próprio estoque de solução salina de equilíbrio Hank HBSS sem íons de cálcio e íons de magnésio HBSS com íons de cálcio e magnésio e beam me capto. O etanol começa preparando a solução dois, a solução quatro e, posteriormente, a mistura enzimática um. Primeiro, adicione etanol betta me capto à solução dois até uma concentração final de 0,067 milimolar.

A solução agora é estável por até um mês quando armazenada a quatro graus Celsius. Em seguida, dissolva o pó liofilizado e uma solução rotulada com frasco. Quatro. Usando 0,7 mililitro de tampão de armazenamento, misture suavemente e não vórtice.

Agora prepare a mistura de enzimas um pipetando 1900 microlitros de solução dois e 50 microlitros de solução um em um tubo C. Esta é uma solução suficiente para dissociar 400 miligramas de tecido, portanto, se mais forem dissociados, prepare uma mistura enzimática adicional. Um máximo de 1600 miligramas de tecido cerebral pode ser processado em um tubo C.

A mistura enzimática no tubo C é então incubada a 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Para iniciar a dissociação, pipete um mililitro de HBSS sem íons de cálcio e magnésio no tubo. Coloque o tubo em uma balança, adicione o tecido cerebral e registre sua massa.

Este cérebro de camundongo P quatro pesa cerca de 0,2 gramas. Um cérebro adulto pesaria cerca de 0,4 gramas para todas as amostras de tecido com menos de 400 miligramas. Os volumes de solução que usaremos hoje são adequados.

Se o seu tecido pesar mais de 400 miligramas, aumente todos os volumes de reagentes de acordo, até 1600 miligramas de tecido podem ser processados em um tubo C. Transfira o cérebro do camundongo para o tubo C preparado contendo 1.950 microlitros de enzima pré-aquecida. Misture um e feche bem a tampa.

Agora coloque o tubo C no associador gen max com a tampa para baixo e certifique-se de que o tecido esteja localizado na área do estator. Selecione o programa MCO brain O one e execute o programa. Este é o primeiro de três programas que você executará na dissociação quando o programa terminar.

Remova o tubo C e incube a amostra por 15 minutos a 37 graus Celsius sob rotação lenta e contínua. Usando o rotador de tubo de mistura máxima, o modo de execução do dispositivo corresponde a quatro RPM. Após a primeira incubação, coloque o tubo de volta na dissociação de cabeça para baixo e execute o programa M brain O2. Durante a próxima associação, prepare 30 microlitros de enzima misture dois por 400 miligramas de tecido adicionando 20 microlitros de solução, três a 10 microlitros de solução quatro.

Quando o segundo ciclo associador terminar com 30 microlitros de enzima, misture dois no tubo C diretamente através da abertura selada do septo no centro da tampa. Para garantir a esterilidade, inverta o tubo C suavemente para misturar e não vórtice. Em seguida, coloque o tubo C de volta no rotador do tubo de mistura máxima e incube a amostra por 10 minutos a 37 graus Celsius com mistura de quatro RPM.

Em seguida, a CTU é devolvida ao desassociador máximo suave pela terceira e última vez, e o programa M brain oh three é executado. Quando o terceiro programa estiver concluído, coloque os tubos C no rotador e incube por mais 10 minutos a 37 graus Celsius. Agora centrifugue a amostra brevemente para coletar as células no fundo do tubo.

Agora estamos prontos para filtrar as células. Escolha um filtro de células de acordo com o tamanho do seu tipo de célula de interesse. Se as células que você deseja coletar tiverem mais de 30 micrômetros de diâmetro, como as células kinji, o tamanho dos poros deve ser grande o suficiente para passar corpos celulares desse diâmetro.

Para células positivas proeminentes, um filtro de 30 micrômetros funcionará. Remova o tecido dissociado do tubo C usando pontas de pipeta de 1000 microlitros que se encaixam na abertura selada do septo na tampa do tubo C. Aplicar a suspensão celular ao filtro de pré-separação colocado num tubo de recolha de 15 mililitros.

Para tamanhos de amostra maiores de tubo de 50 mililitros pode ser necessário. Deixe a suspensão da célula passar pelo filtro. Em seguida, lave o filtro adicionando 10 mililitros de solução HBSS com íons de cálcio e magnésio.

Ao trabalhar com quantidades de tecido superiores a 400 miligramas, use até 30 mililitros de HBSS com íons de cálcio e magnésio para a lavagem do filtro. Agora coloque as células no tubo de coleta por centrifugação a 300 Gs por 10 minutos à temperatura ambiente, aspire o supernat completamente e ressuspenda o pellet celular em seu tampão ou meio de escolha. Neste ponto, você pode optar por remover quaisquer detritos de mielina, pois isso pode prejudicar o isolamento celular e a coloração de anticorpos.

Para remover detritos de mielina, sugerimos o uso de grânulos de remoção de mielina. Caso contrário, as células estão prontas para aplicação posterior. Este gráfico de pontos baseado na coloração de iodeto de propídio indica que 97% das células presentes em uma única suspensão celular de entorse de camundongo caseiro, como a suspensão gerada neste vídeo, são viáveis.

Essas células podem ser purificadas ainda mais usando microesferas anti-proeminentes para produzir progenitores neuronais, que quando cultivados em meio neuro máximo, suplementado com B 27 plus, podem formar neuroesferas nesses gráficos de pontos. O benefício do tratamento de suspensões com os grânulos de remoção de mielina é observado. Uma porcentagem significativamente maior de progenitores neuronais proeminentes que expressam é obtida pela separação máxima após a depleção de mielina de uma única suspensão celular.

Acabei de mostrar como preparar a suspensão de célula única do tecido cerebral de camundongo usando a dissociação genix e o kit de dissociação do tecido neural. Ao fazer este procedimento, é importante ter todas as soluções preparadas adequadamente para a escolha certa do kit de dissociação do tecido neural, T ou P. Consulte a nota de aplicação ou folha de dados do NDK. Usando este método, as seções de tecido embrionário, bem como as seções de tecido D ou todo o cérebro podem ser processadas em condições estéreis de maneira padronizada e com economia de tempo.

Obrigado por assistir e boa sorte para seus experimentos.