Name: Dendra2 Photoswitching דרך החלון דימות השד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: למדו פרוטוקול לדימות תאי גידול מסומנים ב-Dendra2 בחלון דימות השד בעכבר. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר התנהגות מטסטטית של תאי סרטן במיקרו-סביבת הגידול לאורך מספר ימים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי משרד ההגנה האמריקאי (BC075554 לב&quot;ג ו BC061403 אל DK), ארה&quot;ב National Institutes of Health (U54GM064346 כדי JvR; CA100324 אל JC, ג&#39;ס ואת ג&quot;ו; CA77522 כדי ג&#39;ס, U54CA126511 אל JC ו BG). אנו מודים ד Entenberg לעזרה עם מיקרוסקופיה, מ Rottenkolber לעזרה בייצור של תיבת הדמיה ג&#39;יי פולארד (אלברט איינשטיין קולג &#39;לרפואה) עבור נוגדן F4/80.

<ol><li>Farina, K. L., Wyckoff, J. B., Rivera, J., Lee, H., Segall, J. E., Condeelis, J. S., Jones, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+motility+of+tumor+cells+visualized+in+living+intact+primary+tumors+using+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein.</a> Cancer Res. 58, 2528-2532 (1998).</li>
<li>Naumov, G. N., Wilson, S. M., MacDonald, I., Schmidt, E. E., Morris, V. L., Groom, A. C., Hoffman, R. M., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+expression+of+green+fluorescent+protein%2C+coupled+with+high-resolution+in+vivo+videomicroscopy%2C+to+monitor+steps+in+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cellular expression of green fluorescent protein, coupled with high-resolution in vivo videomicroscopy, to monitor steps in tumor metastasis.</a> J Cell Sci. 112, 1835-1842 (1999).</li>
<li>Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+gene+expression%2C+angiogenesis+and+physiological+function+in+tumors+using+multiphoton+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy.</a> Nature Med. 7, 864-868 (2001).</li>
<li>Wang, W., Wyckoff, J. B., Frohlich, V. C., Oleynikov, Y., Huttelmaier, S., Zavadil, J., Cermak, L., Bottinger, E. P., Singer, R. H., White, J. G., Segall, J. E., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+behavior+in+metastatic+primary+mammary+tumors+correlated+with+gene+expression+patterns+revealed+by+molecular+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Single cell behavior in metastatic primary mammary tumors correlated with gene expression patterns revealed by molecular profiling.</a> Cancer Res. 62, 6278-6288 (2002).</li>
<li>Sidani, M., Wyckoff, J., Xue, C., Segall, J. E., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+microenvironment+of+mammary+tumors+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Probing the microenvironment of mammary tumors using multiphoton microscopy.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 151-163 (2006).</li>
<li>Wyckoff, J. B., Wang, Y., Lin, E. Y., Li, J. F., Goswami, S., Stanley, E. R., Segall, J. E., Pollard, J. W., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+macrophage-assisted+tumor+cell+intravasation+in+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors.</a> Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).</li>
<li>Egeblad, M., Ewald, A. J., Askautrud, H. A., Truitt, M. L., Welm, B. E., Bainbridge, E., Peeters, G., Krummel, M. F., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).</li>
<li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Adrian, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2604-2609 (2003).</li>
<li>Kedrin, D., Gligorijevic, B., Wyckoff, J., Verkhusha, V. V., Condeelis, J., Segall, J. E., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat. Methods. 5, 1019-1021 (2008).</li>
<li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nat. Protocols. 2, 2024-2032 (2007).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>PBS ללא Ca, Mg</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO, על ידי Life Technologies</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>מדיום DMEM (תאי MDA-MB-231)</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>איסופלוראן (Aerrane)</td><td>Baxter International Inc.</td><td># NDC 10019-773-40</td><td></td></tr><tr><td>עכבר SCID</td><td>המכון הלאומי לסרטן</td><td>לא רלוונטי</td><td></td></tr><tr><td>כלי תרבית</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td>הזמנה מותאמת אישית</td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית עגול 8 מ"מ</td><td>סיינטיפיק, אינק. (Scientific, Inc.)</td><td>8CIR-1-FIS</td><td></td></tr></tbody></table>

dendra2 photoswitching דרך החלון דימות השד

Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

בעשור האחרון, מיקרוסקופיה intravital של גידולים בשד אצל עכברים וחולדות ברזולוציה של תא בודד<sup&gt; 1-4</sup&gt; הביא תובנות חשובות מנגנונים של התנהגות גרורתי כגון הפלישה הגירה intravasation של תאים סרטניים<sup&gt; 5, 6</sup&gt;, אנגיוגנזה<sup&gt; 3</sup&gt; ואת התגובה החיסונית תאים<sup&gt; 7-9</sup&gt;. יש לנו דיווחה לאחרונה טכניקה קרצינומות תמונה orthotopic החלב במשך מספר מפגשים הדמיה intravital בעכברים חיים<sup&gt; 10</sup&gt;. לשם כך, פיתחנו חלון דימות השד (MIW) ופרמטרים הדמיה אופטימיזציה עבור Dendra2<sup&gt; 11</sup&gt; Photoswitching הדמיה<em&gt; In vivo</em&gt;. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לייצור MIW, החדרת MIW על גבי הגידול והדמיה של Dendra2 שכותרתו תאים סרטניים באמצעות תיבת מותאם אישית הדמיה בנוי. פרוטוקול זה יכול לשמש לדימוי התנהגות גרורתי של תאים סרטניים microenvironments ברורים גידולים מאפשר הדמיה לטווח ארוך של כלי דם, תאים סרטניים ותאים המארח.

Photoswitching Intravital ומעקב אחר Dendra2 שכותרתו תאים סרטניים דרך החלון הדמיה החלב היא טכניקה המאפשרת לנו תמונת התנהגות גרורתי של תאים סרטניים microenvironments הגידול נבחר על זמנים של ימים.

Dendra2 Photoswitching דרך החלון דימות השד

בעשור האחרון, מיקרוסקופיה תוך-חיה (intravital microscopy) של גידולי שד בעכברים ובחולדות ברזולוציה של תא בודד1-4 סיפקה תובנות חשובות לגבי...

סרטון זה מדגים פרוטוקול המתחיל בהזרקת שלולית תאי גידול המבטאים חלבון פלואורסצנטי אל רקמת השומן של בלוטת העשייה בעכבר. תא ייעודי לדימוי in vivo נבנה ולאחר מכן מושתל בניתוח בבעל החיים, ומרגע זה ניתן לאסוף נתוני דימוי. שלום, אני ד"ר ויק מהמעבדה של ד"ר ג'ון קונדי וד"ר ג'פרי סיגל מהמרכז לביופוטוניקה בבית הספר לרפואה של אלברט איינשטיין.היום נדגים לכם פרוצדורה למיתוג פוטוני אינטרה-ויטלי (intravital photo switching) והדמיה של תאי סרטן המסומנים ב-DRA two באמצעות חלון הדמיה של זיכרון. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את השפעת הסביבה המיקרו-סביבתית של הגידול על ניידותם של תאי הגידול. בואו נתחיל, תוךneathביית כפפות לטקס.התחילו בייצור חלון הדימוי של בלוטת החלב, או MIW, על ידי חימום של צלחת תרבית רקמה בקוטר 5 עד 10 סנטימטרים ויצירת משטח מעוקל באמצעות לחיצה של חפץ קשיח ועגול, כגון מקדח Dremel של שים אחד, כנגד הצלחת. גזרו את מרכז הצלחת באמצעות להב תער מחומם. כעת השתמשו במקדח Dremel קטן בצורת קונוס כדי ליצור חור בקוטר של 6 עד 7 מילימטרים במרכז בסיס הפלסטיק בצורת כיפה.החליקו לחלוטין את קצוות הבסיס הפלסטי על ידי שיוף עם מכשיר ה-Dremel ולישוף נוסף. שייפו את החלק העליון של הבסיס הפלסטי כדי ליצור משטח שטוח עבור זכוכית הכיסוי. קוטרו של המשטח השטוח המשויף צריך להיות 9 עד 10 מילימטרים.בשלב הב

dendra2-photoswitching-through-the-mammary-imaging-window

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה אנו מבצעים הדמיה תוך-חיונית של תאי סרטן שהוזרקו מראש במודל עכבר דרך חלון גולגולת מושתל. טכניקת הדמיה זו ברזולוציה גבוהה של קיטועי זמן מאפשרת לחקור התנהגות דינמית של תאים סרטניים בעכבר החי.

הדמיה תוך-חיונית מבוססת חלון גולגולת במודל עכבר: טכניקת הדמיה לחקר ההתנהגות של תאי סרטן שהוזרקו מראש במוח של מודל מורין

כאן, אנו מתארים טכניקה לאספקה מקומית של ריאגנטים לבלוטת החלב של הארנב באמצעות זריקה תוך-צינורית. בנוסף, אנו מתארים פרוטוקול להדמיה ואישור מסירה על ידי הדמיית אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה של חומרי ניגוד.

משלוח Intraductal אל ארנב חלב בלוט

כאן אנו מתארים שיטה עבור ברזולוציה גבוהה בזמן הדמיה multiphoton של תאים סרטניים במוח לפני ואחרי התערבות כירורגית פולשנית (למשל, ביופסיה) בתוך חיה חיה אותו. שיטה זו מאפשרת ללמוד את ההשפעה של אלה הליכים כירורגי פולשנית על תאים סרטניים ' נדידה, פולשנית, והתנהגות מתרבים ברמת תא בודד.

האורך הדמיה של התנהגות המוח תאים סרטניים בתגובה ביופסיה פולשנית כירורגית

כאן מוצגת גישה להדמיה תוך-ורידית ארוכת טווח באמצעות חלונות סיליקון שקופים אופטית, הניתנים להדבקה ישירות לרקמה/איבר המעניין ולעור. חלונות אלה זולים ורב-תכליתיים יותר מאחרים הנהוגים כיום בשטח, וההחדרה הכירורגית גורמת לדלקת מוגבלת ולמצוקה לבעלי החיים.

הדמיה תוך-ורידית אורכית דרך חלונות סיליקון שקופים

פרוטוקול זה מתאר חלון הדמיה חדש של יונקים עם מכסה הניתן להחלפה (R.MIW). מיקרוסקופיה תוך-ורידית לאחר השתלת ה-R.MIW מאפשרת הדמיה אורכית ורב-יומית של בלוטת החלב הבריאה והחולה עם רזולוציה תאית בשלבי ההתפתחות השונים.

מיקרוסקופיה תוך-ורידית אורכית באמצעות חלון הדמיה של יונקים עם מכסה הניתן להחלפה

שיטת ההדמיה התוך-ורידית המתוארת כאן משתמשת בדור ההרמוני השני של הקולגן ובפלואורסצנציה אנדוגנית מהקו-פקטור המטבולי NAD(P)H כדי לפלח באופן לא פולשני מיקרו-סביבה של גידול ללא תווית לתוך תאי גידול, סטרומל וכלי דם לצורך ניתוח מעמיק של תמונות תוך-ורידיות 4D.

גישת סגמנטציה ללא תווית להדמיה תוך-ורידית של מיקרו-סביבה של גידולי יונקים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה קלה להדמיה תוך-חיונית של בלוטת החלב של עכבר מניק, באמצעות סריקת לייזר, מיקרוסקופ קונפוקלי ומולטיפוטון.

מיקרוסקופיה תת-תאית תוך חיונית של בלוטת החלב

אנו מציגים פרוטוקול להשתלה כירורגית של חלון אופטי מיוצב להדמיה ברזולוציה תת-תאית של הלבלב המורין, המאפשר מחקרים סדרתיים ואורכיים של הלבלב הבריא והחולה.

חלון מיוצב להדמיה תוך חיונית של הלבלב המוריני

קליפתיים זרימת הדם דינמיקה ניתן ללמוד in vivo על ידי הדמיה צבעי ניאון dextran מוזרק לווריד הזנב של מכרסמים עם מיקרוסקופיה 2-פוטון. סרט הווידאו הזה מראה כיצד דם תמונה הדינמיקה לזרום הניאוקורטקס של עכברים באמצעות הכנה זכוכית מכוסה, חלון גולגולתי.

שיטה הדמיה 2-פוטון של זרימת הדם הניאוקורטקס דרך חלון גולגולתי

מיקרוסקופ אור הוא כלי בסיסי ביולוג של התא, שהיה צריך הבנה מעמיקה של איך זה עובד, איך זה צריך להיות מתואם עבור יישומים שונים, ואיך זה צריך להישמר כפי שנדרש כדי להשיג קיבולת מקסימלית להרכיב תמונה ורזולוציה. הרכיבים של המיקרוסקופ מתוארים בפירוט כאן.

הרכיבים העיקריים של מיקרוסקופ אור

למדו פרוטוקול לדימות תאי גידול מסומנים ב-Dendra2 בחלון דימות השד בעכבר. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר התנהגות מטסטטית של תאי סרטן במיקרו-סביבת הגידול לאורך מספר ימים.

Dendra2 Photoswitching דרך החלון דימות השד

גלה סרטונים נוספים