Name: הדמיה Exocytosis בתאים עם הפרעה דו רשתית מיקרוסקופית TIRF (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: למד הדמיה של אקסוציטוזה בבלוטיות רשתית של דגי זהב באמצעות מיקרוסקופיית TIRF. השיטה מאפשרת לחקור דינמיקה של בועיות סינפטיות ושחרור נוירוטרנסמיטרים בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי NIH גרנט EY 14990.

<ol><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li>
<li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport%2C+capture+and+exocytosis+of+single+synaptic+vesicles+at+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones.</a> Nature. 406, 849-854 (2000).</li>
<li>Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+association+and+exocytosis+at+ribbon+and+extraribbon+sites+in+retinal+bipolar+cell+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).</li>
<li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Rouze, N. C., Schwartz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continous+and+transient+vesicle+cycling+at+a+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse.</a> J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).</li>
</ol>

היתרונות של מיקרוסקופיה TIRF אובייקטיבית מסוג הן כי 1) הוא מספק חתך אופטית מעולה ידי הגבלת אור עירור לאזור צר בתוך המטוס מוקד של המטרה, ובכך לצמצם out-of-להתמקד אור; 2) מאז אור טיפות אקספוננציאלית עם המרחק תנועה בכיוון אנכי ניתן לנטר כשינוי עוצמת הקרינה, 3) אוסף אור יעיל דרך אובייקטיבית הצמצם גבוה המספרי 1,5. החיסרון העיקרי של השיטה הוא שהיא מוגבלת לאירועים הדמיה קורה בתוך &amp; 100 ננומטר של תא השטח, וזה שווה בערך סעיף Ultrathin במיקרוסקופ אל...

הדמיה exocytosis בתאים עם הפרעה דו רשתית מיקרוסקופית tirf

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

החזר סך פנימית הקרינה (TIRF) מיקרוסקופיה היא טכניקה המאפשרת לימוד של אירועים קורה קרום התא, על ידי הדמיה סלקטיבית של מולקולות ניאון, כי הם הקרובים ביותר חומר המדד גבוה השבירה כגון זכוכית<sup&gt; 1</sup&gt;. במאמר זה, אנו מיישמים את הטכניקה הזו כדי exocytosis תמונה של שלפוחית ​​סינפטית של תאים ברשתית דו קוטבית מבודד הרשתית דגי זהב. נוירונים אלה מתאימים מאוד לסוג זה של מחקר בגלל מסופי האקסון גדול שלהם. על ידי לחיצה בו זמנית תיקון התאים דו קוטבית, ניתן לחקור את הקשר בין מתח טרום סינפטית ושחרור הסינפטי<sup&gt; 2,3</sup&gt;. שלפוחית ​​Synaptic בתוך התא מסופי דו קוטבית נטענים עם פלורסנט לצבוע (FM 1-43 ®) על ידי שיתוף ומתנשף לצבוע ופתרון הצלצול המכיל K גבוה<sup&gt; +</sup&gt; ריכוז על המסופים הסינפטיים. זה depolarizes התאים ומעורר ספיגת צבע וכתוצאה מכך אנדוציטוזה לתוך שלפוחית ​​glutamatergic. לאחר שטיפת צבע עודף משם כ 30 דקות, תאים מוכנים להיות תיקון הידק הדמיה בו זמנית עם לייזר 488 ננומטר. הפתרון פיפטה תיקון מכילה פפטיד rhodamine מבוסס נקשר באופן סלקטיבי את RIBEYE סרט הסינפטי חלבון<sup&gt; 4</sup&gt;, ובכך תיוג סרטים במיוחד כאשר מסופי הם צילמו עם לייזר 561 ננומטר. זה מאפשר איתור מדויק של אזורי פעיל הפרדת הסינפטי מ חוץ הסינפטי האירועים.

בסרטון זה אנו מדגימים כיצד התווית לדמיין שלפוחית ​​יחיד exocytosis הסינפטי וסחר רשתית דג זהב תאים דו קוטבית באמצעות הקרינה הכוללת פנימי ההחזרה (TIRF) מיקרוסקופיה.

הדמיה Exocytosis בתאים עם הפרעה דו רשתית מיקרוסקופית TIRF

מיקרוסקופיית פלואורסצנציה בהחזרה פנימית מלאה (TIRF) היא טכניקה המאפשרת לחקור אירועים המתרחשים בממברנת התא, באמצעות בחירה סלקטיבית של...

הליך זה מתחיל בדיסקציה של הרשתית העצבית של דגי זהב בוגרים, שהיא הרקמה העצבית בחלק האחורי של העין. הרשתית מוצבת בתמיסה אנזימטית למשך 35 דקות, נשטפת ומעובדת באמצעות פיפטת זכוכית מלוטשת באש כדי להפריד את התאים. לאחר מכן, התאים נזרעים על לוחות כיסוי מזכוכית בעלת מקדם שבירה גבוה ומועברים למנות תרבית רקמה מפלסטיק.תאים ביפולריים מבודדים מזוהים על ידי המורפולוגיה המובחנת של מסופי הטעינה שלהם. אנו מזריקים אליהם בשיטת puff למשך 10 שניות תמיסה המכילה FM 1 43 וממתינים 30 שניות לפני שטיפת הצבע. לאחר שטיפה של 30 דקות, התאים עוברים patch clamp ודימוי באמצעות מיקרוסקופיית TIRF.שלום, שמי כריסטינה ג'ובי ממעבדת ZEC במחלקה לפיזיולוגיה תאית ומולקולרית בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת יאל. היום נציג בפניכם פרוצדורה לבחינת אקסוציטוזה בתאי ביפולר רטינליים חיים באמצעות מיקרוסקופיית turf. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה כדי לחקור מנגנונים של שחרור סינפטי.אם כן, בואו נתחיל. ראשית, יש לבצע הסתגלות לחושך לדג זהב למשך 30 דקות לפחות לפני הניתוח. לאחר עריפת הראש והוצאת העיניים, הניחו גלגל עין אחד על פיסת נייר סינון והשתמשו בקצהו של להב סקלפל מספר 11 כדי לנקב את ה-scleral limbus. בתוך החור שנוקב,השתמשו בזוג מספרי בונה (bonna scissors) כדי לחתוך ולהסיר את כל המקטע הקדמי. לאחר מכן, הניחו פיסת נייר סינון קטנה על גבי גב

imaging-exocytosis-in-retinal-bipolar-cells-with-tirf-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת אגר, מוטבע פרוסות רשתית המתאימים electrophysiology ו Ca2 + הדמיה. שיטה זו מאפשרת ללמוד סרט מסוג הסינפסות microcircuits הרשתית באמצעות תיקון ישיר, מהדק הקלטות של אחד מסופי העצב presynaptic.

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

המידור של חלבונים גם בתוך קרום פלזמה או אל מקומות תאיים הוא אחד מנגנון רגולטורי כי יכול מאוד להשפיע על התוצאות איתות, ולכן, כדי להבין איתות חשוב ללמוד את התנהגות במרחב ובזמן של חלבונים המעורבים. המתואר כאן מערכת מבוססת מיקרוסקופיה TIRF ללמוד התמרה האות בתאי T, אבל הוא החלים רחב.

טכניקה מיקרוסקופית TIRF הדמיה בזמן אמת סימולטני של TCR וחלבונים הקשורים אליו לשידור אותות

מקור: Daniele, F., et. al בדיקות GFP רגישות ל-TIRFM ו-pH להערכת דינמיקת שלפוחית נוירוטרנסמיטר בתאי נוירובלסטומה SH-SY5Y: הדמיית תאים וניתוח נתונים. J. Vis. exp. (2015). סרטון זה מדגים את ההדמיה של תאי נוירובלסטומה אנושיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית כוללת (TIRF) כדי להמחיש שלפוחיות סינפטיות מתויגות פלואורופור. התאים מתמקדים תחילה במצב אפיפלואורסצנטי. לאחר מכן נעשות התאמות כדי להשיג השתקפות פנימית מוחלטת, וליצור גלים חולפים המעוררים באופן סלקטיבי פלואורופורים ליד הממברנה. לפני...

הדמיית תאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת

מקור: Winkle, C. C., et al. שימוש במתודולוגיות משולבות להגדרת תפקיד אספקת קרום הפלזמה במהלך הסתעפות אקסון ומורפוגנזה עצבית. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF) להמחשת אירועים אקסוציטיים בנוירונים בקליפת המוח. סמן חלבון פלואורסצנטי ירוק רגיש ל-pH (GFP) זוהר עם איחוי שלפוחית, עם עירור TIRF סלקטיבי הלוכד אקסוציטוזיס קרום-פרוקסימלי בהדמיית זמן-lapse.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת להדמיה של אירועים אקזוציטיים 

ההשתקפות הפנימית מוחלטת המבוסס על קיטוב מיקרוסקופ פלואורסצנטי (pTIRFM) מאפשר זיהוי של דינמיקת קרום תא בזמן אמת. מאמר זה מתאר את היישום של pTIRFM לחקר שיפוץ קרום במהלך exocytosis המוסדר. הטכניקה היא להכליל לתהליכים אחרים בביולוגיה של תא באופן ישיר או עקיף כרוך בשינויים בצורת קרום.

הדמיה פלזמה ממברנה עיוותים עם pTIRFM

אנדוציטוזיס בתיווך קלת'רין, תהליך מהיר ודינמי ביותר שמפנים חלבונים רבים, כולל קולטני איתות. הפרוטוקול המתואר כאן מדמיין ישירות את הקינטיקה של אירועים אנדוציטיים בודדים. זה חיוני להבנת האופן שבו חברי הליבה של המנגנון האנדוציטי מתאמים זה עם זה, וכיצד מטען החלבון משפיע על תהליך זה.

חזותי אנדוציטוזה בתיווך clathrin של רצפטורים מצמידים חלבון G בהחלטה חד אירוע באמצעות TIRF מיקרוסקופית

מאמר זה מספק שיטה לחקירת דינמיקת שלפוחית נוירוטרנסמיטר בתאי נוירובלסטומה, באמצעות מבנה synaptobrevin2-pHluorin ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת. מדווחת גם האסטרטגיה שפותחה לעיבוד תמונה וניתוח נתונים.

TIRFM וGFP-בדיקות pH רגיש להערכת נוירוטרנסמיטר שלפוחיות Dynamics בתאי SH-SY5Y נוירובלסטומה: הדמיה נייד וניתוח נתונים

כאן אנחנו פירוט שיטת הדמיה תא בשידור חי של אקסוציטוזה מוסדר. שיטה זו משתמשת FITC-לתוספי, אשר צוברת ב הקשורות ליזוזום organelles, בתור כתב. שיטה פשוטה זו מאפשרת גם הבחנה בין מצבים שונים של אקסוציטוזה מווסתת בתאים קשה לתמרן גנטית.

הדמיה FITC-לתוספי כעיתונאית אקסוציטוזה מוסדר

הדמיית in vivo היא כלי רב עוצמה לחקר הביולוגיה בבריאות ובמחלות. פרוטוקול זה מתאר הדמיה טרנס-אימונית של רשתית העכבר באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי של שני פוטונים. הוא גם מדגים שיטות שונות של הדמיה חיה כדי לתייג פלואורסצנטיות קבוצות תאים מרובות של הרשתית.

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

עבודה זו מציגה תכשיר רשתית שטוח חלופי שבו הסרת גופי תאים קולטי אור מאפשרת פיזור נוגדנים מהיר יותר וגישה משופרת של פיפטת טלאי לנוירונים ברשתית הפנימית לצורך אימונוהיסטוכימיה, הכלאה באתרו וניסויים אלקטרופיזיולוגיים.

רשתית מפוצלת כהכנה שטוחה משופרת לחקר נוירונים בשכבה גרעינית פנימית ברשתית בעלי חוליות

מאמר זה מדגים שיטה לדמיון וכימות תנועתיות מיקרוגליה ומגע עם פונקטות פוסט-סינפטיות ברשתית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב.

הדמיה חיה ואפיון של דינמיקת מיקרוגליה ואינטראקציות עם סינפסות ברשתית עכברים חולים

למד הדמיה של אקסוציטוזה בבלוטיות רשתית של דגי זהב באמצעות מיקרוסקופיית TIRF. השיטה מאפשרת לחקור דינמיקה של בועיות סינפטיות ושחרור נוירוטרנסמיטרים בזמן אמת.

הדמיה Exocytosis בתאים עם הפרעה דו רשתית מיקרוסקופית TIRF

גלה סרטונים נוספים