Name: Colheita e Preparação Drosophila Os embriões para Gravação eletrofisiológicos e outros procedimentos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Aprenda a dissecar embriões de Drosophila para registrar eletrofisiologicamente o sistema neuromuscular. Este método expõe o SNC ventral, nervos periféricos e musculatura para estudos de desenvolvimento neuromuscular.

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Parte 1: Equipamentos e Suprimentos <ol><li> Um microscópio de dissecção bom é necessário para dissecção embrião; aumento de 40 vezes é sugerido, com 25X de olhos pedaços ao máximo aumentar a ampliação. </li><li> Forceps multa (número 5) são necessários para a seleção manual de embriões e devitellinization de embriões. </li><li> Equipamentos para fazer e modificar agulhas finas de vidro é necessário. Puxado vidro agulhas são necessários para a dissecção. Nós preferimos vidro sólido para dissecção (duram mais), mas tubos de vidro padrão de paredes espessas (diâmetro externo 1-1,5 mm) funciona tão bem. Algumas pessoas usam agulhas de tungstênio fino, eletrolítica para a nitidez desejada em um banho de 1M NaOH utilizando uma bateria de 10 + autotransformador Amp. Agulhas dissecção afiada de tungstênio têm o benefício que eles são relativamente resistentes e de longa duração. Agulhas de vidro oco (formada semelhante a correção eletrodos grampo) estão ligados a tubos de plástico e usado durante a dissecção para sucção e expulsão de solução salina, bem como a liberação controlada de cola. Uma variedade de puxadores de vidro estão disponíveis para a fabricação de agulhas de vidro. Computador programado extratores podem ser predefinidos para puxar uma variedade de formas e tamanhos. A Brown-Flaming modelos (Sutter Instrument Co.) são amplamente favorecidos. Um microscópio composto (20-40X objetivo) deve estar disponível para inspecionar e modificar eletrodos antes do uso. </li><li> Dois tipos de soluções são comumente usados ​​para o banho de tecidos embrionários durante a dissecção: 1) &quot;standard&quot; (Jan e Jan, 1976a) ou &quot;padrão modificado&quot; (Broadie, 2000) salinas, com base em soluções comumente utilizadas para a gravação em outros sistemas de invertebrados e 2) &quot;hemolinfa-like&quot; (HL) salinas (Stewart et al 1994), um compromisso entre a solução salina padrão e as concentrações iónicas medidas na hemolinfa Drosophila. Note-se que nenhuma dessas salinas imitar com precisão a composição química da hemolinfa in vivo (Broadie, 2000). Padrão de solução salina contém (em mM): 135 NaCl, KCl 5, 4 MgCl 2, CaCl 2 1,8, 72 de sacarose, 5 TES, pH 7.2. Experimentadores também pode querer considerar salina inseto comercialmente preparado (Media Insect por exemplo Schneider), que é inadequado para a gravação eletrofisiológicas mas muito provavelmente para proteger a saúde dos tecidos expostos. </li></ol> Parte 2: Estadiamento Embrião e Dissection <ol><li> Para coleta de ovos ideal, manter jovens (&lt;7 dias), do sexo masculino saudáveis ​​e moscas fêmeas (20-40) em potes de doce, que por 2-3 dias. Deitado potes comumente consistem em copos de 100 ml de plástico (Tri-Pour) perfurada para proporcionar a circulação de ar adequada, cobrindo uma placa de agar 60 mm. Placas de ágar contém maçã ou suco de uva temperado com agar. Existem várias receitas, mas um exemplo é a seguinte: 700 ml de água, 25-30 agar gramas, 300 ml de suco concentrado (uva ou maçã), 0,5 g metil paraben (p-hydroxymethylbenzoate), e 30g de açúcar. Autoclave da água e ágar, e, separadamente, ferver a p-hydroxymethylbenzoate com o açúcar e suco. Misture o suco de agar e soluções e rapidamente despeje em placas de 60 mm, removendo as bolhas. </li><li> Antes da coleta de ovos, as moscas são alimentados com pasta de levedura (7 gramas de fermento de padeiro em 9 ml de água armazenada a 4 ° C) em placas fresca, trocada pelo menos duas vezes por dia durante pelo menos dois dias. De dia 3, um bom vaso deve produzir 100-200 ovos por hora. Postura melhor ovo é observado em um pote mantido em seu lado com o agar na placa riscada. Muitos embriões serão colocados dentro ou ao lado da arranhões. </li><li> Para coletar um grande número de embriões, delicadamente a transferência dos embriões a partir da placa de ágar em uma cesta usando um pincel. A cesta pode ser feita com um tubo de centrífuga de 15 ou 50 ml. Cortar o fundo deixando área de superfície suficiente para prender uma tela (70 mesh mm) entre a tampa ea parte superior do tubo. Enxágüe os embriões com dH 2 0 e colocar em uma placa de Petri de lixívia 50% a 100% fresca para remover o córion exterior. Alternativamente, os ovos podem ser recolhidos individualmente usando uma pinça fina, e dechorionated, colocando-os manualmente em uma gota de água sanitária. De-chorionation pode levar de 30 segundos a dois minutos (lixívia fresca é muito mais rápido), e devem ser monitorizados sob o microscópio de dissecação. Remoção do córion expõe a brilhante, membrana vitelina transparente. Dechorionated ovos deverão ser lavados brevemente, ou colocados em solução salina, como alvejantes destrói rapidamente os tecidos devitellinized. </li><li> É fundamental cuidadosamente estágio embriões para a idade desejada de desenvolvimento. Os estágios definidos Drosophila embrionárias (1-17; Campos-Ortega e Hartenstein, 1985) não são úteis, como todo o desenvolvimento funcional neuromuscular ocorre em 16 fase tardia ou estágio 17. Assim, os embriões são encenadas por hora de desenvolvimento a 25 ° C em uma incubadora umidificada, em horas após a fecundação ou, mais comumente, após a postura de ovos (AEL). Sob essas condições, a embriogênese dura 21 + / - 1 hr a 25 ° C. </li><li> Ovos de uma cronometrado ovo-lay (1-2 hrs) que estão devidamente idosos são vistas próximas de critérios morfológicos. Após a lavagem extensiva em dH 2 O, os ovos dechorionated são colocados em uma placa de cultura de plástico (sob dH 2 O) para visualização. Preparação correta pode ser confirmada com a critérios morfológicos usando luz refletida com um microscópio de dissecção (Campos-Ortega e Hartenstein, 1985). Madura fase final de embriões (22-24h AEL) à beira de incubação são geralmente reconhecidos pela segmentação da cutícula e traquéia inflado. Embriões também podem ser genotipados utilizando GFP balanceadores e um microscópio de fluorescência dissecção com filtros adequados. </li><li> Para dissecção, embriões e dechorionated developmentally encenado estão ligados (lado dorsal para cima) em uma lamela em uma gota de solução salina (veja o passo 1.5). Embriões são retirados da membrana vitelina por punção da membrana perto da extremidade anterior ou posterior com uma micropipeta de vidro ou a agulha de tungstênio, e, em seguida, suavemente libertando o embrião da membrana. Em preparação para a dissecação, o embrião deve ser posicionado sobre a lamela com a superfície até dorsal (face dorsal até dissecção irá expor o sistema nervoso e ventral neuromusculature para experimentos. No entanto, o embrião pode, obviamente, ser posicionados em outras maneiras de facilitar o acesso a outros tecidos.) </li><li> Embriões em estágio precoce (&lt;16 hrs AEL) atribuem directamente para limpar o vidro ou o vidro revestido com polilisina (poli-L-lisina hydrobromide; Broadie e Bate, 1993a, b). Embriões mais velhos (&gt; 16 hrs AEL), após a formação da cutícula, deve ser colado, de preferência para Sylgard revestido (Dow Corning) lamínulas. A água-polimerização cola de cianoacrilato cirúrgicos ou veterinários é usado (Broadie e Bate, 1993c, d). A cola é entregue através de uma pipeta de vidro pequeno eletrodo (10-20 micrômetros ponta diâmetro interno) anexado a um tubo de borracha com o fluxo de cola controlado por pressão na boca. Cuidados devem ser tomados durante a entrega de cola, como a cola polimeriza rapidamente, ao contatar a solução salina. Note também que a colagem não pode ser realizada em solução salina sem ou com baixas concentrações de íons bivalentes, como a cola exige íons divalentes para polimerizar. Pequenas quantidades de cola são utilizados pela primeira vez para anexar firmemente a cabeça ea cauda. </li><li> Uma vez que as extremidades do embrião são colados à lamela, uma incisão é feita no dorso com um eletrodo de vidro ou a agulha de tungstênio afiadas. Isso é facilitado pelo cuidado perfurantes da linha de incisão antes de fazer o corte final. Os lados da incisão são, então, ligado à lamela com mais cola, para delicadamente espalhar o apartamento embrião. Os órgãos internos, incluindo o intestino, órgãos de gordura e, opcionalmente, traquéia são então removidas por sucção usando uma pipeta de vidro ligado a tubos de borracha (Broadie eo Bate 1993a-c). O embrião agora deve ser anexado plana para as lamelas, epiderme para baixo com o sistema central nervoso ventral, nervos periféricos, e somáticas musculatura expostos para a experimentação. </li></ol>

Encenação precisa de embriões é crítica devido à maturação rápida de propriedades funcionais ao longo do tempo de apenas algumas horas. Várias questões complicar este teste. Primeiro, a maioria dos pesquisadores usa ovo cronometrado estabelece a fase de embriões, mas o tempo de postura pode variar enormemente de animal para animal em diferentes condições (Broadie et al. 1992). Em particular, as fêmeas em uma dieta limitada tendem a reter ovos fertilizados por períodos prolongados antes do assentamento. Portanto, é funda...

<table><tbody><tr><td>Coletores de embriões</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100 (para placa de 60 mm; outros tamanhos disponíveis)</td><td>Os coletores também podem ser feitos em laboratório usando béqueres tri-pour perfurados, conforme mostrado no vídeo</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>Disponível em várias empresas</td><td>A cola cirúrgica adere melhor a lamínulas revestidas com sylgard</td></tr><tr><td>Tubos de vidro fino, diâmetro externo de 1,0-1,5 mm</td><td>Vários</td><td></td><td>Para puxar e formar agulhas de vidro finas para dissecação e tubos para aplicação de cola</td></tr><tr><td>Tubo plástico, para acoplar ao pipeta de vidro para sucção bucal e aplicação de cola</td><td>Tygon</td><td></td><td>O diâmetro interno do tubo deve corresponder ao diâmetro externo do vidro.</td></tr></tbody></table>

colheita e preparação drosophila os embriões para gravação eletrofisiológicos e outros procedimentos

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila é um modelo premier genética para o estudo de ambos o desenvolvimento embrionário e neurociência funcional. Tradicionalmente, esses campos são muito afastadas umas das outras, com histórias em grande parte independentes e comunidades científicas. No entanto, a interface entre esses campos normalmente díspares são os programas de desenvolvimento subjacente aquisição de propriedades funcionais elétricos de sinalização e diferenciação das sinapses químicas funcionais durante as fases finais da formação de circuitos neurais. Esta interface é uma área extremamente importante para a investigação. Em Drosophila, estas fases de desenvolvimento funcional ocorrem durante um período de &lt;8 horas (a 25 ° C) durante o último terço da embriogênese. Este período final de desenvolvimento foi considerado por muito tempo intratáveis ​​devido a investigação para a deposição de um resistente, impermeável cutícula epidérmica. Um avanço de avanço foi a aplicação de cola de água polimerização cirúrgica que pode ser aplicado localmente para a cutícula para que a dissecção controlada de embriões em estágio avançado. Com uma incisão dorsal longitudinal, o embrião pode ser deitadas, expondo o cordão nervoso ventral e musculatura da parede do corpo à investigação experimental. Este sistema tem sido fortemente usada para isolar e caracterizar mutantes genéticos que impedem a formação da sinapse embrionárias e, assim, revelar os mecanismos moleculares que regem a especificação e diferenciação das conexões sinápticas funcionais sinapse e propriedades de sinalização.

Esta técnica expõe a Drosophila neuromusculature embrionárias para imuno-histoquímica ou gravação eletrofisiológico. É útil para o estudo de eventos no início do desenvolvimento neuromuscular ou a realização de eletrofisiologia em mutantes que não podem eclodir.

Colheita e Preparação Drosophila Os embriões para Gravação eletrofisiológicos e outros procedimentos

A Drosophila é um modelo genético fundamental para o estudo tanto do desenvolvimento embrionário quanto da neurociência funcional. Tradicionalmente, esses campos são bastante...

Para realizar gravações eletrofisiológicas em embriões de drosófila, eles devem primeiro ser coletados, alinhados e dissecados; uma dissecção controlada é possível com cola cirúrgica polimerizável à base de água, que estabiliza os embriões sobre lamínulas. Os órgãos internos são então removidos dos embriões estabilizados para expor o sistema nervoso central ventral, os nervos periféricos e a musculatura somática. Olá, sou Dave Featherstone do Departamento de Ciências Biológicas aqui da Universidade de Illinois em Chicago.Olá, eu sou Ton do Laboratório de Dave Featherstone, do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade de Illinois em Chicago. Hoje vamos mostrar como coletar e dissecar manualmente embriões em estágio avançado de Joof. Utilizamos este procedimento geral em laboratório para preparar testes eletrofisiológicos do desenvolvimento e da função do sistema neuromuscular de Joof, o que mostrarei em uma próxima apresentação da JoVE.Então vamos começar. Este protocolo inicia-se com a coleta de embriões, um procedimento comum utilizado em diversos experimentos de joof, que agora iremos revisar. Estabeleça uma mistura de 20 a 40 moscas jovens machos e fêmeas em um pote de postura.Mantenha-os em uma câmara umidificada a 25 graus Celsius. Para estimar com precisão o estágio de desenvolvimento do embrião, a temperatura e a umidade devem ser constantes. Embora haja potes comerciais para postura, eles podem ser construídos a partir de béqueres plásticos perfurados de 100 mL que se encaixam em placas de maçã de 60 milímetros.A receita da broca de maçã pode ser encontrada no protocolo escrito. Perfurações no béquer podem ser feitas com uma sonda aquecida e devem ser menores do que as moscas adultas. As placas são suplementadas com uma bolus de pasta de levedura, o que estimulará as fêmeas a depositar muitos ovos; misture levedura e água até obter uma consistência semelhante à de manteiga de amendoim e, em seguida, espalhe sobre as placas com uma espátula.Altere o prato duas vezes ao dia, batendo as moscas para fora do prato. Agora posso colocar um novo prato, que pode voltar para a incubadora. Mas, entretanto, posso verificar quantos ovos foram postos aqui até o terceiro dia.Um bom pote deve produzir de 100 a 200 ovos por hora, com o maior número de ovos depositados entre o amanhecer e o final da manhã. Para facilitar a coleta, faça arranhões ou entalhes com um cinzel na placa coletora do parafuso sem-fim; a maioria dos ovos será posta dentro ou ao lado desses arranhões neste procedimento. As moscas são deixadas para pôr ovos por uma a duas horas, de modo que embriões em estágio avançado possam ser coletados, embora esse período varie dependendo do experimento.Os métodos de coleta de embriões também variarão dependendo do número de embriões necessários para o experimento. Para dissecação e eletrofisiologia, são necessários relativamente poucos embriões, caso em que podem ser cuidadosamente retirados das placas com pinças finas. Para remover o córion externo, lave os embriões com água destilada e coloque-os em uma placa contendo solução fresca de 50 a 100% de água sanitária, monitorando os embriões ao microscópio estereoscópico.Após 30 a 120 segundos, o córion se dissolverá, expondo a membrana vitelina brilhante e transparente. Como o hipoclorito pode destruir rapidamente os tecidos vitelinos, os ovos desclorados devem ser brevemente enxaguados ou colocados em solução salina. Coloque os ovos desclorados em uma placa de cultura de plástico contendo água destilada.Neste momento, eles podem ser genotipados visualmente mediante a verificação de marcadores GFP com um microscópio estereoscópico de fluorescência e filtros apropriados; após separar os de interesse, prossiga com a dissecação. Como os embriões são muito pequenos para o uso de agulhas de dissecação, é necessária alguma preparação avançada. Embriões mais velhos, com cutículas desenvolvidas, devem ser colados em lamínulas revestidas com sogar utilizando cola cirúrgica ou veterinária de cianoacrilato, também conhecida como histo aal.O azul funciona bem porque polimeriza em contato com solução contendo íons bivalentes. Inicie a dissecação transferindo um embrião de interesse para uma lâmina de microscópio revestida com cigarro sob uma gota de solução salina, com o lado dorsal voltado para cima. Remova a membrana vitelina fazendo uma pequena incisão na membrana com uma micropipeta de vidro ou uma agulha de tungstênio.Em seguida, libere suavemente o embrião da membrana. Embriões em estágios iniciais aderirão diretamente ao vidro limpo ou ao vidro revestido com poli-L-lisina. Para embriões mais velhos, fixe-os em lamínulas revestidas com sardelha aplicando cola cirúrgica por meio de uma pequena pipeta de vidro acoplada a um tubo de borracha.O fluxo da cola é controlado pela boca. Use pequenas quantidades de cola para fixar firmemente a cabeça e a cauda. Faça isso com cuidado, pois a cola se mistura rapidamente no meio salino.Para dissecar o embrião estabilizado, perfure suavemente uma linha ao longo da linha média dorsal com um eletrodo de vidro ou uma agulha de tungstênio afiada. Usando a mesma ferramenta, faça uma incisão cortando através das perfurações. É fundamental que a agulha de dissecação esteja sempre em um ângulo raso para evitar danificar a musculatura neuromuscular ventral.Em seguida, remova os órgãos internos utilizando sucção suave pela boca com uma pipeta de vidro conectada a uma mangueira de borracha. Aplane o embrião fixando as bordas da incisão ao lamínula com mais cola. Uma vez que todos os órgãos internos tenham sido removidos por sucção, o sistema nervoso periférico do SNC ventral e a musculatura somática ficam expostos para experimentação.Neste momento, o embrião está pronto para gravações eletrofisiológicas ou pode ser fixado para imunohistoquímica e microscopia subsequente usando técnicas convencionais. Acabamos de mostrar como isolar e dissecar embriões em estágios mais avançados até os embriões mais macios. A aplicação de cola cirúrgica e a dissecação dos embriões serão frustrantes no início, mas não existem truques secretos.Você precisa desenvolver as habilidades motoras finas com prática durante várias semanas, mas gradualmente a porcentagem de dissecações bem-sucedidas aumentará. Consulte nosso outro vídeo geo, que detalha as configurações de gravação de células musculares e neurônios motores. É isso aí.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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