שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

שלום, אני ברוס דרייפר מאוניברסיטת קליפורניה דייוויס, מהמחלקה לביולוגיה מולקולרית ותאית, ואני ססיליה מואנס מהחטיבה למדעי הבסיס במרכז פרד הוטצ'יסון למחקר הסרטן בסיאטל. היום, ססיליה ואני נדגים את הפרוטוקול לשימור בהקפאה (cryopreservation) של זרע דגי זברה, המהווה התאמה לפרוטוקול המקורי של בריאן הארווי. נראה לכם כי בעבודה בצוותים של שניים, ניתן לשמר בהקפאה זרע מ-100 זכרים בודדים בפחות משעתיים.

למרות שקיים טווח רחב של פוריות לאחר הפשרה, בממוצע אנו מקבלים 25% פוריות, וזאת מספרייה שהוקפאה במשך למעלה משבע שנים. אם כך, בואו נתחיל. לפני ביצוע פרוצדורה זו, הכינו תחילה את תמיסות הקפאת הזרע.

מכינים תמיסת Ginsburg Fish ringer טרייה מדי שלושה ימים, ואת תווך ההקפאה מכינים מדי יום, עם ובלי methanol. את הרכב התמיסות ניתן למצוא במידע המשליים המקוון המצורף לפרוטוקול זה. לחומרים המשמשים בהליך זה עשויה להיות השפעה על קצב ההקפאה וההפשרה, אשר בתורם עשויים להשפיע על פוריות הזרע ההקפוא.

מסיבה זו, רשימה של חומרים מומלצים מסופקת גם כמידע מקוון משלים. עדיף להקפיא את הזרע על קרח יבש גרוס דק במקום על כדוריות של קרח יבש. דרך פשוטה אחת לגרוס קרח יבש היא לעטוף אותו במגבת ולרסק אותו בעזרת פטיש.

שיטה יעילה יותר היא שימוש במטחנת קרח יבש, כגון דגם claws and model RE two, להקפאת זרע של דגי זברה. ראשית, סמנו מבחנות נימיות של 10 µL בעזרת טוש למעבדה בגובה של 3.33 µL, או כ-16.7 mm מהתחתית. כדי להרגיע את הזכרים, הניחו שני עד ארבעה זכרים בכלי כימי המכיל תמיסת trica מדוללת במי דגים. את המתכון ניתן למצוא בספר דגי הזברה.

לאחר ההרדמה, הוצאו את הדגים מהמרדמם באמצעות כף פלסטיק וייבשו אותם בעדינות באמצעות נייר סופג. שימו דגש מיוחד על ייבוש הצד הוונטרלי. מים מפעילים את תאי הזרע, ולכן קריטי לייבש ביסודיות את האזור שסביב ה-ika.

מקם את הדג על תומך הספוג כאשר הצד הגחוני פונה כלפי מעלה. אם האזור שסביב סנפירי הבטן עדיין לח, ייבש אותו בעדינות באמצעות נייר ניגוב מסוג Kim wipe. הכנס את צינור הנימא המסומן למתאם פיפטה גומי המצורף לצינורות הנימא.

המתאם הוא צינור גומי בעל פייה בקצה אחד ומחזיק קפילרה בקצה השני. לחלופין, ניתן לחבר את צינור הקפילרה למזרק Hamilton בנפח 50 microliter. באמצעות קטע קצר של צינור tigon בקוטר המתאים, מקמו את הזכר תחת המיקרוסקופ וחשפו את פתח המערכת העגית-מינית על ידי הרחקה זהירה של סנפירי האגן.

באמצעות קצה צינור הנימי, הוצא את הזרע על ידי ליטוף עדין של דפנות גופו של הדג עם פינצטה חלקה, או על ידי לחיצה עדינה על דפנות גופו של הדג באמצעות האגודל והאצבע המורה; אסוף את הזרע לתוך צינור נימי בעת פליטתו באמצעות שאיבה עדינה. הימנע מצואה שעלולה להיפלט יחד עם הזרע. נפח הזרע המיועד הוא 3.3 µL.

הכמות המינימלית המקובלת של זרע משתנה בהתאם לאיכותו. זרע איכותי הוא לבן ואטום, בעוד שזרע דליל נראה מימי. באופן כללי, הכמות המינימלית המקובלת היא 1 µL של זרע איכותי או שליש מהיעד, ו-2 µL של זרע דליל או שני שלישים מהיעד.

אם נפח הזרע אינו מגיע לנפח היעד של 3.3 microliters, יש לנרמל את הנפח עד לסימון העט באמצעות תווך הקפאה ללא methanol. אם נפח הזרע כבר מגיע לסימון העט על צינור הקפילריה או עולה עליו, יש להמשיך לשלב הבא. כעת הוסיפו את חומר המגן מהקפאה (cryoprotectant) לזרע.

שאבו את תוך ההקפאה עם methanol עד לסימון הכתום. הנפח הכולל המשוער הוא כעת 20 microliters. הוציאו את תערובת הזרע וחומר המגן מפני הקפאה אל שטח נקי של זכוכית שעון, ערבבו בעדינות באמצעות פיפוט למעלה ולמטה כארבע פעמים והימנעו מהחדרת בועות.

חלק את הזרע לשתי מבחנות קריו על ידי פיפטור של 10 µL של תמיסת קריו-פרוטקטור לזרע לתחתית של כל מבחנה מסומנת. סגור את המבחנות במהירות והנח כל מבחנת קריו בתוך מבחנת פלקון נפרדת של 15 mL. בטמפרטורת החדר, סגור את מבחנות הפלקון והכנס אותן לתוך קרח יבש דק.

יש להכניס את המבחנות לעומק מספיק כך שרק הפקקים יבלטו, כדי שניתן יהיה לעקוב אחר מבחנות הפלקון. יש למספר אותן ולתעד את הזמן שבו כל מבחנה הוכנסה לקרח היבש. יש להניח לזרע לקפוא בקרח היבש למשך 20 דקות.

לאחר הקפאת הזרע, העבירו את שני מבחנות הקריו לבקבוק דואר (doer flask) המכיל חנקן נוזלי. לאחסון זמני, הניחו את קופסת ההקפאה באמבט חנקן נוזלי כדי שהדגימות לא יתחממו.

השתמש במלקחי מתכת ארוכים כדי להוציא את המבחנות מבקבוק הדואר וטפל בהן באמצעות כפפות קריוגניות. לחלופין, ניתן להעביר מבחנות קריו ישירות מהקרח היבש למקפיא. אם קופסת המקפיא נשמרת טבולה בחנקן נוזלי בתוך מכל פוליסטירן לאחסון לטווח ארוך, הנח את מבחנות הקריו במקפיא חנקן נוזלי קריוגני.

כדי לשמור על חיוניות הזרע, חיוני שהמבחנות יאוחסנו טבולות בחנקן נוזלי; מבחנות המאוחסנות בשלב האדים עלולות לאבד מחיוניותן עם הזמן. המהירות היא גם גורם קריטי בשמירה על חיוניות הזרע. הזמן שחולף בין הוספת חומר ההגנה מפני הקפאה (cryoprotectant) לבין הנחת מבחנות הזרע על קרח יבש לא יעלה על 30 שניות בהפריה חוץ-גופית (In vitro fertilization).

שימוש בזרע שהקפאי עובד בצורה הטובה ביותר עם שני אנשים. אדם אחד סוחט ביצי מהנקבות בעוד האדם השני מפשיר את הזרע. כוון אמבט מים ל-33 °C.

הוצאו מבחנה קריוגנית ממקפיא החנקן הנוזלי והעבירו אותה לכלי או לבקבוק המכיל חנקן נוזלי עד שהיא תהיה מוכנה להפשרה. סחטו ביצים מנקבות שהורדמו לתוך צלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 35 מילימטר. תהליך זה מתואר בפירוט בפרוטוקול ה-JoVE שכותרתו Making Gyno Genetic deployed zebrafish by early pressure, המספק תיאור מפורט של דגי זברה.

בהפריה חוץ-גופית (In vitro fertilization), מקבץ ביצים טוב מכיל יותר מ-150 ביצים אחידות וצהבהבות. כל שארית לבנה מעידה על התדרדרות. במידת האפשר, נסו להשיג שלושה מקבצי ביצים ולאחדם לכלי אחד.

אם לא התקבלו שלוש קבוצות תאים (clutches) איכותיות תוך דקה מרגע קבלת הקבוצה הראשונה, עברו לשלב הבא. השאירו את הצלחת מכוסה בזמן הפשרת הזרע. בינתיים, הוציאו את המבחנה מהחנקן הנוזלי והסירו את הפקק.

טבל במהירות את המבחנה עד מחציתה באמבט מים של 33 מעלות למשך שמונה עד 10 שניות. הוסף במהירות 70 µL של תמיסת מלחים חוצצת של Hank's בטמפרטורת החדר למבחנה וערבב באמצעות שאיבה והזרקה (pipetting) למעלה ולמטה; הוסף מיד לביצים בצלחת הפטרי וערבב בעדינות עם קצה הפ pipette. לאחר מכן, הפעל מיד את תאי הזרע והביצים על ידי הוספת 750 µL של מי דגים, סובב את המבחנה לערבוב והדגר למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר חמש דקות, מלאו את הצלחת בדגים ובמים, והדגירו בטמפרטורה של 28 degrees Celsius. לאחר שעתיים עד שלוש שעות, ספרו והעבירו עוברים חיוניים לצלחות של 100 millimeter, בקצב של 50 עוברים לצלחת. כמו כן, ספרו את הביצים המופרות כדי שניתן יהיה לקבוע את הפוריות של דגימת הזרע.

פוריות זרע היא היחס בין מספר העוברים החיוניים למספר הביציים הכולל ששימשו להפריה חוץ-גופית. ניתן למיין את הביציים בכל זמן בין שעתיים לשש שעות לאחר ההפריה חוץ-גופית. כאשר ביציים שאינן פוריות ניתנות להבחנה בקלות מעוברים חיוניים, הביציים שאינן פוריות נראות שקופות ולא מחולקות.

בבדיקה באמצעות תאורה תמסורה (trans illumination) תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, הפוריות הממוצעת של זרע שהוקפא בקריוপ্রזרווציה משתנה במידה ניכרת. עם זאת, ניתן להגיע לממוצע של 25% פוריות שיישאר יציב למשך מספר שנים. גרף זה מציג את אחוז הפוריות הממוצע של זרע שהוקפא בין השנים 2001 ל-2003 ונבדק עד לשנת 2008.

הרגע הדגמנו שיטה בעלת תפוקה גבוהה להקפאה ושימור של זרע דגים. בביצוע פרוטוקול זה, חשוב להשתמש בכל כלי הפלסטיק והציוד המומלצים, וכן להשתמש בקרח יבש דחוס וטחון במקום בכדוריות קרח יבש. קריטי להשתמש בזרע וביצית באיכות גבוהה מאוד, ובמקרה של הביציות בעת ביצוע ההפריה חוץ-גופית (in vitro fertilization), לאחר הפשרת הזרע, חשוב להשתמש במספר רב ככל האפשר של ביציות כדי לשפר את מספר העוברים הפוריים שתקבלו בסוף התהליך, מה שעשוי לדרוש שלוש עד ארבע נקבות, נכון?

מרכיב מפתח נוסף בפרוטוקול הוא המהירות. השלב שבין הוצאת הזרע מהזכר להצבתו בקרח היבש לא אמור להימשך יותר מדקה אחת בערך. ובכן, אני חושב שזה הכל.

בהצלחה בניסוייכם.