L'uso del kit di rilevamento a fluorescenza della proteasi per determinare l'attività della proteasi

Questo protocollo inizia aggiungendo un tampone di incubazione, una soluzione di caseina FXI e un campione contenente la proteasi di interesse a una provetta per microcentrifuga, quindi mescolando e incubando delicatamente a 37 gradi Celsius per 60 minuti al buio. Per fermare la reazione proteolitica alla fine del periodo di incubazione, aggiungere una soluzione di TCA, mescolare delicatamente e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti, di nuovo al buio. Questo passaggio causerà la precipitazione del substrato non reattivo.

Centrifugare il campione per 10 minuti. A 10.000 Gs, rimuovere il surnatante, che contiene i frammenti marcati con FXI solubili in acido. Trasferire il surnatante in un veterinario o in una piastra a pozzetti multipli, diluire con il tampone del saggio e leggere il campione su un fluorimetro.

Ciao, sono Carrie Cup Vineyard e sono una scienziata presso la nostra struttura Sigma Aldridge DeKalb a St.Louis, Missouri. Oggi vi mostrerò una procedura per la determinazione dell'attività della proteasi fluorimetrica. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio di controllo qualità per determinare la bassa attività della proteasi.

Quindi iniziamo Per questa procedura, il tampone di incubazione, il tampone di saggio e la soluzione di acido tricloroacetico normale 0,6 o TCA sono forniti come soluzioni pronte all'uso. Aliquotare la soluzione di Caino etichettata con fite in volumi più piccoli e conservarla a meno 20 gradi Celsius. Assicurati di proteggere dalla luce usando fiale di ambra o avvolgendo tubi trasparenti in un foglio di alluminio.

Citare il substrato di fite Cain riduce al minimo la necessità di ripetuti cicli di congelamento e scongelamento, ripetuti cicli di congelamento e scongelamento o miscelazione vigorosi del fite Cain potrebbero portare alla separazione del fite dal Cain, con conseguente background più elevato. Se si calibra il fluorimetro o si determina l'intervallo lineare per il segnale fit e, preparare la soluzione di controllo dell'adattamento. Rendere la soluzione fresca ricostituendola in tampone di saggio alla concentrazione appropriata.

Una volta pronta, proteggere la soluzione dalla luce. Infine, preparare il controllo della tripsina proteasi aggiungendo 100 microlitri di acido cloridrico millimolare alla fiala di tripsina liofilizzata e mescolare brevemente per assicurarsi che la tripsina sia disciolta. La conservazione della tripsina in condizioni acide ne aumenta la stabilità.

Si noti che la soluzione di controllo Tripsin è sensibile alla temperatura e non è stabile a basse concentrazioni. Successivamente, inizia a preparare tutti i campioni del saggio, che includono i campioni di prova e il controllo e il bianco durante il test. Conservare i campioni al riparo dalla luce per ogni campione di prova.

Unire in una provetta da microcentrifuga, 20 microlitri di tampone di incubazione, 20 microlitri del substrato fit c kian e 10 microlitri del campione di prova. Si può usare una microcentrifuga trasparente purché il campione sia incubato al buio. Si noti inoltre che i campioni di prova, che hanno un'elevata attività proteasica, dovranno essere diluiti.

Il campione di controllo della tripsina viene utilizzato come controllo positivo che il test sta eseguendo correttamente per determinare il limite di rilevamento o per creare una curva standard generale per preparare il controllo della tripsina, combinare una parte di tripsina acidificata a nove parti del tampone di incubazione o il tampone utilizzato per i campioni di prova e mescolare bene. La concentrazione finale di lavoro della tripsina è di 20 microgrammi per millilitro. Se si utilizza una proteasi specifica diversa, preparare la soluzione di controllo con quella proteasi specifica e un tampone appropriato.

Continuare a preparare il campione di controllo combinando 20 microlitri di tampone di incubazione, 20 microlitri di substrato di fz cain e 10 microlitri di controllo della tripsina in una provetta da microcentrifuga. Si raccomanda di eseguire almeno un campione di controllo di cinque nanogrammi di tripsina con ogni test o di utilizzare la diluizione seriale. L'ultimo campione è il bianco, preparato combinando 20 microlitri di tampone di incubazione, 20 microlitri del substrato Fitz Caine e 10 microlitri di acqua ultrapura in una provetta da microcentrifuga.

Con i tre tipi di campioni pronti, mescolare delicatamente ogni provetta e incubare a 37 gradi Celsius al buio per 60 minuti. Fare attenzione a non mescolare troppo energicamente poiché una turbolenza eccessiva può causare un elevato fondo di fluorescenza e ridurre la sensibilità del test. Si può incubare fino a 24 ore per aumentare la sensibilità, ma non sono consigliate incubazioni più lunghe poiché la caseina FXI potrebbe iniziare a degradarsi.

Anche in questo caso, quando l'incubazione è completa, utilizzare dispositivi di protezione appropriati per aggiungere 150 microlitri della soluzione di TCA a ciascuna provetta per microcentrifuga. Dopo l'incubazione con TCA si dovrebbe osservare una foschia bianca presente nella provetta, che è la miscela di caino precipitata, non digerita e insolubile delicatamente e incubare a 37 gradi Celsius al buio per 30 minuti. Al termine dell'incubazione con la soluzione di TCA, centrifugare le provette per 10 minuti a 10.000 Gs a temperatura ambiente.

Il surnatante contiene i frammenti di Caino marcati con fite solubili in acido utilizzati per la pipetta di misurazione della fluorescenza delicatamente dalla parte superiore della provetta in modo che nessuno dei precipitati nel pellet venga aspirato nella punta della pipetta, il che causerà una lettura falsa positiva durante il successivo rilevamento fluorescente per misurare l'attività della proteasi utilizzando un fluorimetro combinato 10 microlitri del surnatante TCA con un millilitro del tampone del saggio in una provetta e mescolare delicatamente. Inoltre, diluire lo standard FE per l'analisi aggiungendo 10 microlitri di FE a un millilitro di tampone per saggio. Il controllo FE e lo standard Tripsin forniscono un livello di fluorescenza tale che il campione non deve superare la soluzione del TC. Un surnatante e un tampone di saggio possono essere conservati al buio a una temperatura compresa tra due e otto gradi Celsius per un massimo di 24 ore prima di misurare la fluorescenza.

Se si misura utilizzando un vete, trasferire un millilitro della soluzione in un vete adatto, se deve essere eseguito un gran numero di campioni, è possibile utilizzare una piastra a 96 pozzetti e un lettore di piastre fluorescenti per acquisire dati fluorimetrici. In questo test, l'isotiocianato di fluoresceina viene fornito come controllo per l'eventuale calibrazione dello strumento. Di seguito è mostrato un intervallo di linearità rappresentativo del segnale FS e seguendo la procedura descritta.

L'utilizzo di questo kit con un tempo di incubazione di 30 minuti per la prima fase di incubazione produce questa tipica curva standard per la tripsina e i campioni di controllo che vanno da 1,5 nanogrammi a 25 nanogrammi. Le misure di fluorescenza sono state effettuate in una piastra a più pozzetti. Il limite di rilevazione del saggio è la quantità di proteasi che produce una lettura di fluorescenza significativa superiore al valore ottenuto con il campione bianco.

Oggi vi abbiamo mostrato come utilizzare il kit per la determinazione della proteasi Sigma Aldridge per rilevare l'attività della proteasi metrica fluorescente in un campione biologico. Sebbene questo kit sia ottimizzato per il tuo utilizzo, è importante ricordare che per le tue proteasi particolari potresti aver bisogno di lievi modifiche. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.