Использование протеазы Флуоресцентный Kit обнаружения для определения протеазы активность

Этот протокол начинается с добавления инкубационного буфера, раствора казеина FXI и образца, содержащего интересующую протеазу, в микроцентрифужную пробирку, а затем осторожного перемешивания и инкубации при температуре 37 градусов Цельсия в течение 60 минут в темноте. Чтобы остановить протеолитическую реакцию в конце инкубационного периода, добавьте раствор ТСА, аккуратно перемешайте и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут снова в темноте. Этот шаг приведет к выпадению нереактивного субстрата в осадок.

Центрифугируйте образец в течение 10 минут. При давлении 10 000 G удалите надосадочную жидкость, содержащую растворимые в кислоте фрагменты, меченные FXI. Перенесите надосадочную жидкость в ветеринарный или многолуночный планшет, разведите с помощью буфера для анализа и считайте образец на флуориметре.

Здравствуйте, меня зовут из Carrie Cup Vineyard, и я работаю ученым на нашем предприятии Sigma Aldridge DeKalb в Сент-Луисе, штат Миссури. Сегодня я покажу вам процедуру определения активности флюорометрической протеазы. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории контроля качества для определения низкой активности протеазы.

Итак, приступим к этой процедуре в виде готовых к использованию растворов предоставляются инкубационный буфер, буфер для анализа и 0,6 обычной трихлоруксусной кислоты или раствора ТСА. Аликвотировать раствор фита разбить Каина на меньшие объемы и хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия. Обязательно защитите от света с помощью янтарных флаконов или заверните прозрачные тюбики в фольгу Али.

Цитирование субстрата fite Cain сводит к минимуму необходимость повторных циклов замораживания-оттаивания, повторяющихся циклов замораживания-оттаивания или энергичного встряхивания или перемешивания fite Cain может привести к отделению fite от Cain, что приведет к более высокому фону. При калибровке флуориметра или определении линейного диапазона для сигнала подгонки e подготовьте решение для управления подгонкой. Сделайте раствор свежим, восстановив в пробирном буфере до соответствующей концентрации.

Когда все будет готово, защитите раствор от света. Наконец, приготовьте контроль протеазы трипсина, добавив 100 микролитров одной миллимолярной соляной кислоты во флакон лиофилизированного трипсина, и кратковременно перемешайте, чтобы убедиться, что трипсин растворился. Хранение трипзина в кислых условиях повышает его стабильность.

Обратите внимание, что контрольный раствор Трипсин чувствителен к температуре и не стабилен при низких концентрациях. Затем начните подготовку всех образцов анализа, которые включают в себя тестовые образцы, контрольные и пустые образцы на протяжении всего анализа. Храните образцы в защищенном от света месте для каждого испытуемого образца.

Соедините в микроцентрифужной пробирке 20 микролитров инкубационного буфера, 20 микролитров субстрата fit c kian и 10 микролитров исследуемого образца. Можно использовать прозрачную микроцентрифугу при условии, что образец инкубируется в темноте. Отметим также, что тестовые образцы, которые обладают высокой протеазной активностью, необходимо будет разбавлять.

Контрольный образец трипсина используют в качестве положительного контроля того, что анализ выполняется правильно, чтобы определить предел обнаружения или создать общую стандартную кривую для подготовки контроля трипсина, соединить одну часть подкисленного трипсина с девятью частями инкубационного буфера или буфера, используемого для исследуемых образцов, и хорошо перемешать. Конечная рабочая концентрация трипсина составляет 20 микрограмм на миллилитр. Если вы используете другую специфическую протеазу, приготовьте контрольный раствор с этой конкретной протеазой и подходящим буфером.

Продолжайте подготовку контрольного образца, соединяя 20 микролитров инкубационного буфера, 20 микролитров субстрата fz cain и 10 микролитров контрольного трипсина в микроцентрифужной пробирке. Рекомендуется запускать по крайней мере один контрольный образец трипсина в пять нанограммов с каждым анализом или использовать серийное разведение. Последний образец представляет собой заготовку, приготовленную путем соединения 20 микролитров инкубационного буфера, 20 микролитров субстрата Fitz Caine и 10 микролитров сверхчистой воды в микроцентрифужной пробирке.

Когда три типа образцов готовы, аккуратно перемешайте каждую пробирку и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в темноте в течение 60 минут. Будьте осторожны и не перемешивайте слишком интенсивно, так как чрезмерная турбулентность может вызвать высокий фон флуоресценции и снизить чувствительность анализа. Для повышения чувствительности можно инкубировать до 24 часов, но более длительные инкубации не рекомендуются, так как казеин FXI может начать разлагаться.

Опять же, чтобы получить высокий флуоресцентный фон после завершения инкубации, используйте соответствующие защитные средства, чтобы добавить 150 микролитров раствора ТСА в каждую микроцентрифужную пробирку. При инкубации с ТСА следует наблюдать белую дымку, присутствующую в пробирке, которая представляет собой осажденную, непереваренную и нерастворимую смесь каина и инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в темноте в течение 30 минут. По окончании инкубации с раствором ТСА пробирки центрифугировать в течение 10 минут при 10 000 G при комнатной температуре.

Надосадочная жидкость содержит кислоторастворимые фиты, меченные фрагментами Каина, используемые для измерения флуоресценции пипеткой, аккуратно с верхней части пробирки, так что ни один из осадков в грануле не втягивается в наконечник пипетки, что вызовет ложноположительное считывание во время последующего флуоресцентного детектирования для измерения активности протеазы с использованием флуориметра, объединенного 10 микролитров надосадочной жидкости TCA с одним миллилитром буфера для анализа в пробирке и аккуратно перемешайте. Кроме того, разбавьте стандарт FE для анализа, добавив 10 микролитров FE на один миллилитр буфера для анализа. Контроль FE и стандарт Tripsin дают уровень флуоресценции, при котором проба не должна превышать раствор TC. Надосадочная жидкость и буфер для анализа могут храниться в темноте при температуре от двух до восьми градусов Цельсия в течение 24 часов перед измерением флуоресценции.

При измерении с использованием VETE для переноса одного миллилитра раствора в подходящую VETE, если необходимо обработать большое количество образцов, для получения флуорометрических данных можно использовать 96-луночный планшет и считыватель флуоресцентных планшетов. В этом анализе флуоресцеин изотиоцианат используется в качестве контроля для возможной калибровки прибора. Здесь показан репрезентативный диапазон линейности сигнала FS e в соответствии с описанной процедурой.

Использование этого набора со временем инкубации 30 минут для первого этапа инкубации дает типичную стандартную кривую для трипсина и контрольных образцов в диапазоне от 1,5 нанограмм до 25 нанограммов. Измерения флуоресценции проводили в многолуночном планшете. Пределом обнаружения анализа является количество протеазы, которое дает значительное значение флуоресценции выше значения, полученного с холостым образцом.

Сегодня мы показали вам, как использовать набор для определения протеазы Sigma Aldridge для определения активности метрической протеазы Fluor в биологическом образце. Хотя этот набор оптимизирован для вашего использования, важно помнить, что для ваших конкретных протеаз вам могут потребоваться небольшие модификации. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.