Name: Split-Ubiquitin Basierend Membrane Yeast Two-Hybrid (Mythos) System: Ein wirksames Instrument zur Ermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-01T16:25:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Erfahren Sie, wie das MYTH-System Protein-Protein-Wechselwirkungen in Saccharomyces cerevisiae erfasst. Diese Methode ermöglicht die hochdurchsatzfähige Analyse von Membranproteinen und deren Interaktionspartnern in lebenden Zellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir möchten Morgenröte Edmonds für eine kritische Lektüre des Manuskripts danken. Die Stagljar Labor wird aus Mitteln der kanadischen Stiftung für Innovation (CFI), die Canadian Institute for Health Research (CIHR), der Heart and Stroke Foundation, die Canadian Cancer Society und Novartis unterstützt.

<ol><li>Stagljar, I., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+membrane+protein+interactions+using+yeast-based+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Analysis of membrane protein interactions using yeast-based technologies.</a> Trends Biochem Sci. 27 (11), 559-563 (2002).</li>
<li>Iyer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+the+split-ubiquitin+membrane+yeast+two-hybrid+system+to+identify+protein-protein+interactions+of+integral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Utilizing the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system to identify protein-protein interactions of integral membrane proteins.</a> Sci STKE. 275, pl3-pl3 (2005).</li>
<li>Paumi, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+protein-protein+interactions+for+the+yeast+ABC+transporter+Ycf1p+by+integrated+split-ubiquitin+membrane+yeast+two-hybrid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping protein-protein interactions for the yeast ABC transporter Ycf1p by integrated split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid analysis.</a> Mol Cell. 26 (1), 15-25 (2007).</li>
<li>Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+system+based+on+split-ubiquitin+for+the+analysis+of+interactions+between+membrane+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A genetic system based on split-ubiquitin for the analysis of interactions between membrane proteins in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5187-5192 (1998).</li>
<li>Gisler, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+protein-protein+interactions+between+the+mammalian+integral+membrane+transporters+and+PDZ-interacting+partners+using+a+modified+split-ubiquitin+membrane+yeast+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Monitoring protein-protein interactions between the mammalian integral membrane transporters and PDZ-interacting partners using a modified split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1362-1377 (2008).</li>
<li>Scheper, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+N-glycosylation+and+protein+translocation+across+the+endoplasmic+reticulum+membrane+by+Sss1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Coordination of N-glycosylation and protein translocation across the endoplasmic reticulum membrane by Sss1 protein.</a> J Biol Chem. 278 (39), 37998-38003 (2003).</li>
<li>Thaminy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+ErbB3-interacting+factors+using+the+split-ubiquitin+membrane+yeast+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of novel ErbB3-interacting factors using the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system.</a> Genome Res. 13 (7), 1744-1753 (2003).</li>
<li>Johnsson, N., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+ubiquitin+as+a+sensor+of+protein+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Split ubiquitin as a sensor of protein interactions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (22), 10340-10344 (1994).</li>
<li>Kelleher, D. J., Gilmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Saccharomyces+cerevisiae+oligosaccharyltransferase+is+a+protein+complex+composed+of+Wbp1p%2C+Swp1p%2C+and+four+additional+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Saccharomyces cerevisiae oligosaccharyltransferase is a protein complex composed of Wbp1p, Swp1p, and four additional polypeptides.</a> J Biol Chem. 269 (17), 12908-12917 (1994).</li>
<li>Chevallier, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+transcriptional+control+of+a+eucaryotic+permease+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cloning and transcriptional control of a eucaryotic permease gene.</a> Mol Cell Biol. 2 (8), 977-984 (1982).</li>
</ol>

Igor Stagljar ist ein Mitbegründer der Dualsystems Biotech, Schweiz.

MYTHOS ist das erste System mit hohem Durchsatz, die die Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen full-length Membranproteinen und cytosolische oder membrangebundene Partnern ermöglicht. Es wurde verwendet, um Membranprotein aus einer Reihe von Organismen [3-7] zu studieren. Es gibt jedoch bestimmte Details, die müssen unter die Lupe, um sicherzustellen, das Protein-of-interest zugänglich ist mit MYTHOS Studie werden können. Viele membrangebundene Proteine ​​sind an die Plasmamembran üb...

<table><tbody><tr><td>Polymilchsäure (PEG3350)</td><td>BioShop Canada</td><td>PEG335</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumacetat-Dihydrat</td><td>BioShop Canada</td><td>LIA001</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid)</td><td>BioShop Canada</td><td>XGA001</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamid</td><td>BioShop Canada</td><td>DMF 451</td><td></td></tr><tr><td>3-Amino-1,2,4-triazol (3-AT)</td><td>BioShop Canada</td><td>ATT124</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat, dibasisch</td><td>BioShop Canada</td><td>SPD307</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat, monobasisch</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-500</td><td></td></tr><tr><td>Lachsfisch-Sperma-DNA</td><td>VWR international</td><td>CA80601-120</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>BioShop Canada</td><td>GLU501</td><td></td></tr><tr><td>LB-Bouillon, LENOX</td><td>BioShop Canada</td><td>LBL405</td><td></td></tr><tr><td>Hefe-Stickstoff-Basis</td><td>BioShop Canada</td><td>YNB406</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>BioShop Canada</td><td>YEX401</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Trypton</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP402</td><td></td></tr><tr><td>Adeninsulfat</td><td>BioShop Canada</td><td>ADS201</td><td></td></tr><tr><td>L-Uracil</td><td>BioShop Canada</td><td>URA241</td><td></td></tr><tr><td>L-Threonin</td><td>BioShop Canada</td><td>THR002</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidin</td><td>BioShop Canada</td><td>HIS200</td><td></td></tr><tr><td>L-Methionin</td><td>BioShop Canada</td><td>MET222</td><td></td></tr><tr><td>L-Valin</td><td>BioShop Canada</td><td>VAL201</td><td></td></tr><tr><td>L-Phenylalanin</td><td>BioShop Canada</td><td>PHA302</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucin</td><td>BioShop Canada</td><td>ISO910</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosin</td><td>BioShop Canada</td><td>TYR333</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucin</td><td>BioShop Canada</td><td>LEU222</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginin</td><td>BioShop Canada</td><td>ARG006</td><td></td></tr><tr><td>L-Tryptophan</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP395-100</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysin</td><td>BioShop Canada</td><td>LYS101</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP369-100</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioShop Canada</td><td>AGR001</td><td></td></tr><tr><td>Soda-Lime-Glasperlen</td><td>Biospec Products</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>BioShop Canada</td><td>SLD002</td><td></td></tr></tbody></table>

split-ubiquitin basierend membrane yeast two-hybrid (mythos) system: ein wirksames instrument zur ermittlung von protein-protein-wechselwirkungen

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Die grundlegenden biologischen und klinischen Bedeutung von integralen Membranproteinen veranlasste die Entwicklung einer Hefe-basiertes System für die Hochdurchsatz-Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionen (PPI) für full-length Transmembranproteine. Zu diesem Zweck entwickelt unser Labor das Split-Ubiquitin-basierten Membrane Yeast Two-Hybrid (Mythos) System. Diese Technologie ermöglicht den empfindlichen Nachweis von transienten und stabilen Protein-Wechselwirkungen mit<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Als Wirtsorganismus. MYTHOS nutzt die Beobachtung, dass Ubiquitin in zwei stabile Einheiten getrennt werden können: Die C-terminale Hälfte von Hefe-Ubiquitin (C<sub&gt; Ub</sub&gt;) Und die N-terminale Hälfte des Ubiquitin-Einheit (N<sub&gt; Ub</sub&gt;). Im Mythos wird dieser Grundsatz für den Einsatz als &quot;Sensor&quot; von Protein-Protein-Wechselwirkungen angepasst. Kurz gesagt, ist die integrale Membranproteine ​​Köderprotein zu C verschmolzen<sub&gt; Ub</sub&gt; Was ist es, eine künstliche Transkriptionsfaktor gebunden. Prey Proteine, entweder in einzelnen oder Bibliothek-Format werden die N verschmolzen<sub&gt; Ub</sub&gt; Einheit. Protein-Interaktion zwischen den Köder und Beute führt zum Auflösen des Ubiquitin-Einheiten bilden eine full-length &quot;pseudo-Ubiquitin-Molekül. Dieses Molekül wiederum ist durch cytosolische deubiquitinating Enzyme erkannt, was zur Spaltung des Transkriptionsfaktors, und die anschließende Induktion der Expression des Reportergens. Das System ist sehr anpassungsfähig und eignet sich besonders für High-Throughput-Screening geeignet. Es wurde erfolgreich eingesetzt, um Interaktionen mit integralen Membranproteinen aus Hefe-und anderen Organismen zu untersuchen.

MYTHOS ermöglicht den empfindlichen Nachweis von transienten und stabilen Wechselwirkungen zwischen Proteinen, die im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae exprimiert werden. Es wurde erfolgreich angewendet, um exogene und Hefe integrale Membranproteine ​​zu studieren, um ihre Interaktionspartner in einem hohen Durchsatz Weise zu identifizieren.

Split-Ubiquitin Basierend Membrane Yeast Two-Hybrid (Mythos) System: Ein wirksames Instrument zur Ermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Die grundlegende biologische und klinische Bedeutung von integralen Membranproteinen führte zur Entwicklung eines auf Hefe basierenden Systems für den Hochdurchsatz-...

Das MyTH-System basiert auf dem Konzept des geteilten Ubiquitins, das sich auf die Fähigkeit des Ubiquitins bezieht, stabil in die N-terminale Hälfte NUBI und die C-terminale Hälfte CUB getrennt zu werden, die in der Lage sind, sich zu einem vollständigen, pseudo-ubiquitinartigen Molekül neu zu zusammensetzen. Während diese Rekonstitution spontan erfolgt, wenn das Wildtyp-NUBI verwendet wird, verringert die Einführung einer Isoleucin-13-auf-Glycin-Mutation, die ein Fragment namens NUBG erzeugt, die Affinität für CUB erheblich und blockiert somit die Bildung des pseudo-ubiquitinartigen Moleküls. Wenn NUBG und CUB jeweils an Protein A und Protein B fusioniert sind und A und B in der Lage sind, miteinander zu interagieren, kann das pseudo-ubiquitinartige Molekül erneut gebildet werden.In der Mythologie sind integrale Membran-Baits mit einem Angriffsteil fusionsverknüpft, der aus dem CUB-Fragment, das an einen künstlichen Transkriptionsfaktor gekoppelt ist, besteht. Währenddessen sind Preys mit dem NUBG-Fragment verknüpft; eine Interaktion zwischen Bait und Prey führt zur Rekonstitution des Pseudo-Ubiquitins, das wiederum von zytosolischen Deubiquitinierungs-Enzymen erkannt werden kann

split-ubiquitin-based-membrane-yeast-two-hybrid-myth-system-powerful

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir eine neue quantitative Proteomik Verfahren zur Identifizierung von Protein-Komplexen in Saccharomyces cerevisiae. In dieser Studie haben wir die SILAC-Methode zusammen mit Affinitätsreinigung durch Tandem-Massenspektrometrie gefolgt, um mit hoher Spezifität zu identifizieren die Bindungspartner einer ER-Protein, Scs2p verwendet.

Identifizierung von Protein-Komplexen mit der quantitativen Proteomik in S. cerevisiae

Wir haben die konventionelle Hefe-Zwei-Hybrid-Screening, ein wirksames Instrument bei der Identifizierung genetischer Protein-Interaktion verändert. Diese Modifikation deutlich verkürzt den Prozess, reduziert den Arbeitsaufwand und vor allem, reduziert die Anzahl von Fehlalarmen. Darüber hinaus ist dieser Ansatz reproduzierbar und zuverlässig.

Modifizierten Hefe-Zwei-Hybrid-System, um Proteine ​​interagieren mit dem Growth Factor Progranulin Identifizieren

Dieses Video zeigt den Hefe-Zwei-Hybrid-Assay zum Nachweis spezifischer Protein-Selbstinteraktionen. In diesem Assay wird das Protein von Interesse an zwei Domänen eines Transkriptionsfaktors gebunden, der für das β-Galactosidase-Enzym kodiert. Wenn die beiden Proteine interagieren, bewirkt dies, dass Transkription und Translation das Enzym bilden, das dann mit einem biochemischen Assay nachgewiesen wird.

Hefe-Zwei-Hybrid-Assay zur Bestimmung der Protein-Selbstassoziation in Hefezellen

In diesem Video demonstrieren wir den modifizierten Hefe-Ein-Hybrid-Assay, der mehrere Proteine nachweist, die mit der Ziel-DNA interagieren. Die transformierten Hefezellen enthalten die Ziel-DNA-Sequenz stromaufwärts des Reportergens. Zusätzlich exprimieren sie Transkriptionsfaktor-Proteine. Wenn die Proteine Komplexe bilden und an die Ziel-DNA binden, wird das Reportergen exprimiert und kann enzymatisch nachgewiesen werden.

Modifizierter Hefe-One-Hybrid-Assay zum Nachweis von heteromeren Proteinkomplex-DNA-Wechselwirkungen

Verwendung von Protein-Mikroarrays enthält fast die gesamte S. cerevisiae Proteom ist für schnelle unvoreingenommene Abfragetausende von Protein-Protein-Wechselwirkungen in parallel sondiert. Dieses Verfahren kann für die Protein-Kleinmolekül, posttranslationale Modifikation und andere Assays mit hohem Durchsatz verwendet werden.

Probing hoher Dichte Funktionale Protein-Microarrays, um Protein-Protein Wechselwirkungen erkennen

Die Oligomerisierung des Ryanodinrezeptors, eines homo-tetrameren Ionenkanals, der die Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern vermittelt, ist entscheidend für die Kontraktion von Skelett- und Herzmuskeln. In dieser Arbeit stellen wir komplementäre in vivo und in vitro Methoden zum Nachweis der Selbstassoziation von Proteinen und zur Bestimmung der Homo-Oligomer-Stöchiometrie vor.

Genetische und biochemische Ansätze für<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; In Vitro</em&gt; Beurteilung von Protein Oligomerisierung: Der Ryanodinrezeptor Case Study

Bakterielle Effektor-Proteine ​​sind wichtig für den Aufbau erfolgreicher Infektionen. Dieses Protokoll beschreibt die experimentelle Identifizierung von proteinösen Bindungspartner eines bakteriellen Effektor-Protein in seiner natürlichen pflanzlichen Wirt. Die Identifizierung dieser Effektor - Wechselwirkungen über Hefe - Zwei-Hybrid - Screens ist ein wichtiges Instrument in entwirren molekularen Pathogenität Strategien werden.

Die Entwirrung der Funktion eines bakteriellen Effektor aus einem nicht-kultivierter Pflanzenschädling eine Hefe mit Zwei-Hybrid-Screen

Der hier beschriebene modifizierte Hefe-Ein-Hybrid-Assay ist eine Erweiterung des klassischen Hefe-Ein-Hybrid- (Y1H) -Assays, um die heteromere Protein-Komplex-DNA-Wechselwirkung in einem heterologen System für jede funktionelle Genomforschung zu untersuchen und zu validieren.

Ein modifiziertes Hefe-ein-Hybrid-System für Heteromere Protein-Komplex-DNA-Interaktionsstudien

Batch-Verarbeitung von Hefe-2-Hybrid-Bildschirme ermöglicht direkten Vergleich der Interaktion profile mehrere Köder Proteine mit einem hoch komplexen Satz von Fusionsproteinen Beute. Hier beschreiben wir verfeinerten Methoden, neue Reagenzien und ihre Verwendung für solche Bildschirme zu implementieren.

Eine Hefe 2-Hybrid Bildschirm im Batch Proteininteraktionen vergleichen

Hier beschreiben wir eine Methode zur bakteriellen Koexpression von differentiell markierten Proteinen unter Verwendung einer Reihe kompatibler Vektoren, gefolgt von den konventionellen Pulldown-Techniken zur Untersuchung von Proteinkomplexen, die sich in vitro nicht zusammensetzen können.

Pulldown-Assay gekoppelt mit Co-Expression in Bakterienzellen als zeiteffizientes Werkzeug zum Testen anspruchsvoller Protein-Protein-Interaktionen

Die Wechselwirkungen von Biomolekülen, wie z. B. Protein-Protein-Wechselwirkungen, sind die molekulare Grundlage biologischer Funktionen. Wenn interaktions-null/beeinträchtigte Mutanten, denen die relevante Interaktion spezifisch fehlt, isoliert werden können, werden sie wesentlich dazu beitragen, die Funktion(en) dieser Interaktion zu verstehen. Dieser Artikel stellt eine effiziente Methode zur Isolierung von Interaktions-Null-/beeinträchtigten Mutanten vor.

Isolierung von Interaktions-Null-/beeinträchtigten Mutanten mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-Assay

Erfahren Sie, wie das MYTH-System Protein-Protein-Wechselwirkungen in Saccharomyces cerevisiae erfasst. Diese Methode ermöglicht die hochdurchsatzfähige Analyse von Membranproteinen und deren Interaktionspartnern in lebenden Zellen.

Split-Ubiquitin Basierend Membrane Yeast Two-Hybrid (Mythos) System: Ein wirksames Instrument zur Ermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (Video) | JoVE Journal

Split-Ubiquitin Basierend Membrane Yeast Two-Hybrid (Mythos) System: Ein wirksames Instrument zur Ermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Weitere Videos entdecken