Ein Protokoll für die Produktion von KLRG1 Tetramer

Hallo, ich bin Stephanie Resi aus dem Labor von Lauren Parce in der Abteilung für Molekulare Mikrobiologie und Immunologie an der Brown University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Erzeugung von K LRG one Tetrameren. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um kohärente Wechselwirkungen von K LRG one zu untersuchen.

Fangen wir an. Zuerst inokulieren vier 500-Milliliter-Kolben mit TB-Puffer, der geeignete Antibiotika enthält, mit Bakterien, die das Plasmidkonstrukt K LRG 1 exprimieren, und wachsen bei 37 Grad Celsius mit Schütteln, wenn die OD 0,6 erreicht, Angström bei 600 Nanometern induzieren die Expression über den T-7-Promotor unter Zugabe von 0,4 molaren IPTG und inkubieren die Kultur für weitere vier Stunden unter Schütteln bei 37 Grad Celsius. Nach der vierstündigen Inkubation werden die Bakterien in Zentrifugenröhrchen überführt und die Kulturen 20 Minuten lang bei 3000 U/min und vier Grad Celsius heruntergeschleudert.

Bei Bedarf können die Pellets zu diesem Zeitpunkt bei minus 80 Grad Celsius eingefroren werden, um sie zu einem späteren Zeitpunkt zu verwenden. Resus suspendieren Sie die geernteten Zellen in 30 Millilitern Resus Suspension Buffer Next Pool. Bakterielle Resus-Suspensionen bis zu einem Volumen von 60 Millilitern in einem Polypropylen-Becherglas.

Falls erforderlich, wird das Gesamtvolumen mit extra te Puffer PH acht auf 60 Milliliter angehoben und das Gemisch bei halber Geschwindigkeit auf einer heißen Platte gerührt, während die gepoolte Resus-Suspension bei folgenden Lösungen gerührt wird. Tropfen auf die Mischung Lysozym, Magnesiumchlorid D, NS, ein TRITTON X 100. Und schließlich DVB-T.

Übertragen Sie die Lösung mit einem Fisurendismember mit Ultraschallkonverter bei 30% Amplitude in Ultrazentrifugenröhrchen. Die Lösung wird 1,5 Minuten lang auf Eis beschallt und das Lysat 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 5.000 U/min zentrifugiert, der Überstand dekantiert und 15 Milliliter Waschpuffer hinzugefügt. Wiederholen Sie die Beschallung wie zuvor, bis das Pellet vollständig resuspendiert ist, und wiederholen Sie das Zentrifugieren, wiederholen Sie die Schritte Waschen, Unzucht und Pelletieren fünfmal.

Zum Schluss wird das Pellet durch die Wiederbelebung mit einem Waschpuffer suspendiert, der Triton X 100 nicht enthält. Drehen Sie sich erneut herunter und Resus suspendiert in vier Millilitern TE-Puffer. Das sind eure Inklusionsgremien.

Quantifizieren Sie Ihre Inklusionskörper nach Nassgewicht. Die Einschlusskörperaufschlämmung kann bei vier Grad Celsius in Pufferbeständen von 30 bis 100 Milligramm pro Milliliter gehalten werden. Wenn die Einschlusskörper fertig sind, können Sie sich nun auf das erneute Falten vorbereiten.

Beginnen Sie den Faltvorgang, indem Sie eine frische Ein-Liter-Flasche Faltpuffer vorbereiten und bei niedriger Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius umrühren, um zu kühlen. Als Nächstes bereiten Sie sieben Injektionen der Einschlusskörper für die Injektion in den Rückfaltungspuffer vor. Zuerst wird der Bestand an Einschlusskörperaufschlämmung in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Endvolumen von 1,4 Millilitern in sieben molaren Guineehydrochlorid plus 10 Millimolar Strahl Mercaptoethanol in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 30 bis 40 Minuten geschmolzen.

Alle fünf Minuten wirbeln. Sie werden wissen, dass das Schmelzen abgeschlossen ist. Wenn die Gülle klar wird.

Zentrifugieren Sie die geschmolzene Mischung 30 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge bei vier Grad Celsius. Achten Sie dann darauf, dass sich keine kleinen schwärzlichen Kügelchen ansammeln. Den Überstand in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen umfüllen.

Stellen Sie das Volumen auf sieben Milliliter ein, wobei der Injektionspuffer injiziert werden soll. Erhöhen Sie zunächst die Rührgeschwindigkeit der Faltmasse auf hoch. Fügen Sie dann einen Milliliter verdünnte Einschlusskörper hinzu.

Tropfen für Tropfen mit nur zwei Sekunden zwischen jedem Tropfen. Fügen Sie jeweils einen Milliliter verdünnte Einschlusskörper hinzu, wobei zwischen den Injektionen jeweils eine Stunde zwischen den Injektionen liegt. Rührgeschwindigkeit auf niedriges O zurücksetzen.

Über Nacht bei niedriger Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius weiterrühren. Die Proteine sind dann bereit für die Konzentration und Reinigung. Um mit der Konzentration der zurückgefalteten KLRG ein Tetramere zu beginnen.

Zuerst wird die Reaktion mit einem 22-Mikrometer-Filter vorfiltriert. Konzentrieren Sie dann die Reaktion von einem Liter auf etwa 10 Milliliter unter Verwendung einer Millipore-Amon-Rührzelle und einer Ultrafiltrationsmembran mit nominalem Molekulargewicht von 10 Kilodalton gemäß den Anweisungen des Herstellers und S. Dann unter Verwendung einer Millipore Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewicht von 10 Kilodalton auf weniger als oder gleich zwei Milliliter konzentrieren.

Lassen Sie Ihr Chromatographiesystem gemäß den Anweisungen des Herstellers einrichten. Wir verwenden das ACTA-System für schnelle Proteinflüssigkeiten von GE Healthcare bei vier Grad Celsius unter Verwendung einer hochauflösenden Säule. Die Monomerform von K lrg, einer von 20 Millimolaren Haufen und 150 Millimolar Natriumchlorid, wird durch Größenausschlusschromatographie gereinigt.

Das injizierte Volumen sollte weniger als 2 % des gesamten Gelvolumens der Säule betragen. Auch hier wurde unter Verwendung eines Millipore 10 Kilodalton Molekulargewichts-Cutoff-Ultrafiltrationsmembrankonzentrats auf ein Endvolumen von einem Milliliter das KLG-Monomer gemäß den Herstellerangaben gegessen. Eliminieren Sie das freie Biotin, indem Sie wie zuvor mit der Größenausschlusschromatographie reinigen, um Tetramer zu erhalten.

Mischen Sie die KL LRG one Monomere mit einem vierfachen molaren Überschuss an FICO rine; konjugierte Streptavidin-Tetramere stehen jetzt für die Markierung von Rezeptorliganden zur Verfügung. Diese Grafik zeigt ein positives Ergebnis der Trennung von gefalteten K lrg one Proteinen mittels Größenausschlusschromatographie von links nach rechts. Die Peaks veranschaulichen die Multimer-Dimer- und Monomerformen von K LRG one.

Der Peak ganz rechts stellt den Pufferaustausch dar. Obwohl die Wiederfaltungsbedingungen für jedes Protein empirisch getestet werden müssen, sollten andere Lektinrezeptoren vom C-Typ in der Lage sein, Tetramer mit einem ähnlichen Protokoll zu sein, was die potenzielle Identifizierung anderer Liganden ermöglicht. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie bei diesem Verfahren den KLRG-One-Teer generieren.

Es ist wichtig, daran zu denken, die Induktionsstufen zu überprüfen und sich strikt an die Bedingungen für die Wiederfaltung zu halten. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.