المنطقة Subventricular اون الوجه : يلطخ Wholemount والتدفق البطانة العصبية

مرحبا ، أنا زمان. أنا أرتورو ألفاريز بيا. نحن هنا في مختبر أرتورو اليوم ، وهو جزء من قسم جراحة المخ والأعصاب ومركز إيلي إديث برود لطب التجديد وأبحاث الخلايا الجذعية ، وسنعرض لك كيف نقوم بإعداد حوامل كاملة لجدران البطين الجانبية.

يمكن استخدام هذه الحوامل بأكملها إما ثابتة للتلطيخ المناعي أو كمستحضرات حية لتحليل التدفق الجنائي. تم تطوير تقنية التثبيت الكاملة التي سيوضح لك مان اليوم على مر السنين في المختبر وتم إتقانها لدراسة جدار البطين الجانبي بالكامل ، بما في ذلك الخلايا العقابية والنشاط الجرثومي الأساسي في المنطقة تحت البطينية حيث توجد الخلايا الجذعية العصبية. تم تطويره في الأصل بواسطة Fiona Dutch ثم تم إتقانه بواسطة HIE Victor و Casu Moto.

كلهم لم يعودوا في المختبر. توضح المخططات التالية كيفية تحضير حامل كامل للجدار الجانبي للبطين الجانبي. ينقسم الدماغ أولا إلى نصفي الكرة الأرضية.

يتم إجراء قطع إكليلي للخلف للكشف عن الحصين والمقطع العرضي الموضح هنا باللون الأرجواني. ثم يتم تقشير الجدار الإنسي ، الذي يغطي الحصين ويظهر باللون الأرجواني ، بعيدا عن الجدار الجانبي ، الذي يغطي الطبقة الضالة ويظهر باللون الوردي. سيتم نشر الجدارين بعيدا عن بعضهما البعض مثل فتح كتاب ، وسيتم قطع الجدار الإنسي بعيدا عن ترك الجدار الجانبي مكشوفا.

يتناول القسم الأول من هذا الفيديو تشريح التثبيت بالكامل ، ولكن قد لا تكون هذه هي الخطوة الأولى. ترتيبا زمنيا ، إذا كانت الخطط تتضمن تحليل التدفق الجنائي ، فيرجى الرجوع إلى البروتوكول المكتوب للحصول على التفاصيل قبل كل تشريح ، تأكد من أن جميع الأدوات معقمة وفي متناول اليد. ضع طبق تشريح بحجم ستة سنتيمترات بوسط 37 درجة مئوية ، ووسط ليتز L 15 تحت مجهر استريو تشريح فلوري ، وضع دماغ فأر تشريح حديثا في الطبق تحت المجهر الاستريو.

استخدم الملقط الدقيق لتشريح البصيلات الشمية. استخدم سكين طعنة لتقسيم الدماغ إلى نصفي الكرة الأرضية. قطع الإكليل في الطرف الخلفي لنصف الكرة الأرضية.

لفضح الحصين الحري والمقطع العرضي ، أدخل سكين الطعن في الفراغ البطيني الصغير بين القشرة والحصين ، وقم بقصه لتحرير القشرة حيث تتصل ظهريا بالحصين. اقطع إسفينا من القشرة في الزاوية واستخدم ملقطا دقيقا لتقشيره ببطء بعيدا عن الحصين. استمر في تقشير القشرة وهي تلتف حول الحافة البطنية للحصين.

استخدم سكين طعنة لتحرير الحصين من الأجزاء البطنية من القشرة. استخدم السكين والملقط الناعم لسحب الحصين بعيدا عن القشرة. المضي قدما بعناية من الأمام دون الإضرار بجدران البطينين.

يجب أن يفتح الجداران بعيدا عن بعضهما البعض. مثل كتاب بالسكين ، قم بقطع أجزاء القشرة المتدلية على الجدار الجانبي. لتصور هذا السطح بشكل أفضل مع زيادة مقاومة التراجع ، يجب إجراء قطعتين إضافيتين.

واحد ظهريا حيث تلتقي الجدران الإنسية والجانبية ، وقطع مماثل بطنيا. استخدم ضربات صغيرة من سكين الطعن لعمل هذه التخفيضات. تسمح هذه التخفيضات الإضافية بسحب الجدار الإنسي بشكل أكبر للكشف عن الجزء الأمامي من البطين.

اضبط الإضاءة بحيث تكشف الظلال عن التقاطع بين الجدران الإنسية والجانبية. كوادي بين الجدارين. استخدم السكين للقطع بالضبط في الوادي ، وإزالة المهاد وأي قشرة متدلية.

يجب استخدام حامل الثقب على الفور لتحليل التدفق الجنائي. في حالة تشريح حوامل الثقب للتلوين المناعي ، يمكن تشريح العديد من حوامل الثقب في جلسة واحدة إذا كانت مغمورة في المثبت عند اكتمالها. سيوضح القسم التالي من الفيديو كيفية إجراء فحوصات لتدفق السوائل الناتجة عن الخلية البطانية العصبية النخيزة.

باستخدام الميكروبيدات الفلورية. يتم تثبيت ذوبان ثقب الجدار الجانبي الذي تم تشريحه حديثا أولا في طبق التشريح باستخدام دبابيس حشرية. ثم يتم إنزال طرف الماصة الزجاجية الدقيقة المملوءة بالميكروبيدات الفلورية على سطح الحامل بأكمله، ويتم ترسيب حبات الفلورسنت برفق على السطح أثناء الفاصل الزمني.

يسجل الفيديو حركة الخرزات لمقايسة تدفق الإلحاق. يجب تحضير ماصة زجاجية دقيقة قبل تشريح الحامل بالكامل كما هو موضح في الجزء المكتوب من هذا البروتوكول. يجب أن تحتوي الماصة النهائية على تفتق ناعم ضحل وشطبة بزاوية 45 درجة بقطر داخلي يبلغ حوالي 100 ميكرومتر.

ردم ماصة الزيت المعدني عن طريق العمل الشعري في منتصف الطريق تقريبا. أدخل مكبس مغموس بالشحوم مفرغة في الجزء الخلفي من الماصة. ثم ادفعه للداخل لدفع الغضروف المفصلي للزيت إلى طرف الماصة.

قم بتثبيت الماصة بمكبس بمناور دقيق على ذراع قابل للتعديل. قم بتحميل الماصة بمحلول من 50٪ ميكروبيدات فلورية و 5٪ جلسرين و 45٪ ماء. قم بتشريح حامل ثقب حديثا كما هو موضح سابقا ، وانقله إلى جانب البطين لأعلى إلى طبق تشريح نظيف مملوء ب 37 درجة مئوية.

وسط Leitz ، قم بتثبيت حامل الثقب في طبق التشريح باستخدام دبابيس حشرية في المهاد والقشرة الظهرية الأمامية. ضع قاعدة الذراع الثابتة التي تمسك المعالج الدقيق بجوار المجهر المجسم، مع إبقاء الذراع مرفوعة لتجنب كسر إبرة الماصة الدقيقة. اغمس طرف الماصة الدقيقة في أنبوب متوسط لتنظيف الميكروبيدات من الجزء الخارجي من الحافة.

الحرص على عدم كسر الحافة. ضع طرف الماصات فوق السطح الظهري للجدار الجانبي وقم بخفض الذراع لوضع طرف الماصة فوق سطح الأنسجة مباشرة. ركز على مجال الرؤية الذي يشمل النصف الأمامي من حامل الثقب ، وابدأ في تسجيل الصور المطلوبة.

استخدم المكبس لإخراج ما يقرب من خمسة لترات من الخرزات الدقيقة على سطح تثبيت الفتحة. بمجرد إزالة البلعة الأولية للحبات عن السطح عن طريق التدفق الجنائي ، استخدم المكبس لإخراج خمس جولات نانولتر إضافية من الميكروبيدات. يمكن تحليل التدفق والاتجاه والسرعة باستخدام الفيديو المسجل.

يوضح القسم الأخير من هذا الفيديو كيف يتم تلطيخ حوامل الثقب بالمناعة وتثبيتها على الشرائح للتصوير متحد البؤر. يتم نقل حوامل الثقب التي تم تشريحها حديثا أولا إلى صفيحة 24 بئر ويتم تثبيتها عن طريق الغمر في الألدهيد الطلائلي. يتبع ذلك سلسلة من الحضانات في الأجسام المضادة الثانوية الأولية ثم المترافقة بالفلورسنت مع الغسيل المتداخل.

بعد التلوين ، يتم تشريح الحوامل بأكملها لفصل الطبقة الرقيقة فقط من الجدار الجانبي الذي يحتوي على المنطقة تحت البطينية بعيدا عن ما تبقى من حامل الثقب الذي يحتوي على الطبقة القاتلة والقشرة الأساسية. ثم يتم نقل هذه القطعة الرقيقة المسطحة من الأنسجة إلى شريحة وانزلق الغطاء لتثبيت حوامل الثقب لبرودة تلطيخ المناعة. صفيحة 24 بئرا تحتوي على 4٪ بارالديهايد و 0.1٪ تريتون × 100 على الجليد.

في غطاء الدخان الكيميائي ، يغمر برفق جانب البطين المثبت على ثقب تشريح لأعلى داخل بئر واحد من اللوحة. قم بإصلاح العينة طوال الليل عند أربع درجات مئوية ، واستنشق المثبت واستخدم ماصة نقل لغسل حامل الثقب بعناية في XPBS واحد مع 0.1٪ Triton X 103 مرة لمدة خمس دقائق لكل منهما. بالنسبة لجميع خطوات التعامل مع السوائل، ضع الماصة برفق على جانب البئر لتجنب قلب حامل الثقب وإتلاف الأنسجة.

أضف محلول مانع يحتوي على تريتون X و 10٪ مصل الماعز العادي في XPBS واحد يستخدم ما يصل إلى 2٪ Triton X. احتضان الحامل بالكامل في محلول الحجب لمدة ساعة واحدة. في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة محلول الحظر.

أضف الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول مانع واحتضان أربع درجات مئوية لمدة 24 أو 48 ساعة اعتمادا على غسل المستضد المستهدف بغسول سريع من XPBS واحد مع تريتون X ، متبوعا بثلاث غسلات لمدة 20 دقيقة لكل منها في درجة حرارة الغرفة ، أضف الأجسام المضادة الثانوية المخففة في محلول مانع واحتضان أربع درجات مئوية لنفس الفترة الزمنية لغسل الأجسام المضادة الأولية بنفس الطريقة مثل غسل الأجسام المضادة الأولية بنفس الطريقة للأجسام المضادة الأولية. توضح السلسلة التالية من الخطوات كيفية تشريح الجدار الجانبي فقط من ما تبقى من الحامل بأكمله كعينة مسطحة واحدة. يمكن بعد ذلك تركيبه للتصوير عالي الدقة.

أعد موقع البطين المثبت على ثقب البقع المناعية إلى طبق تشريح نظيف مملوء بجهاز XPBS واحد تحت المجهر الاستريو والانتقال من الخلف إلى الأمامي. استخدم سكين طعنة لإزالة القشرة الظهرية ، وهي جسم ثفني أبيض أساسي من أجل تصور الواجهة بين المنطقة تحت البطين والأوعية الدموية. ثم قم بعمل قطع أفقي طويل عبر الجانب البطني للحامل بأكمله.

استخدم ملقطا دقيقا لتوجيه الأنسجة على هذه الحافة المسطحة الجديدة بحيث يكون السطح الظهري متجها لأعلى. المنطقة تحت البطينية عبارة عن شريط رفيع من الأنسجة الوردية المتجانسة بينما يتم اختراق المخطط بواسطة حبال من المادة البيضاء. استخدم الملقط كدبابيس في AUM الحادي لتثبيت الأنسجة دون الإضرار بجدار البطين.

بدءا من الأمام. استخدم سكين الطعن لبدء القطع بعناية بين المخطط والمنطقة تحت البطينية. من المهم الحفاظ على الجروح موازية لسطح البطين والحفاظ على سمك الأنسجة التشريح.

حيث تضعف المنطقة تحت البطين في الخلف. قم بإزالة جميع الأنسجة المحيطة بعناية من حوامل الثقب التي ليست جزءا من جدار البطين. يجب أن يكون حامل الثقب بسمك موحد بين 200 و 300 ميكرومتر.

استخدم الملقط لرفع قطعة من الأنسجة من الأسفل ونقلها إلى شريحة مجهرية. ضع وسط التثبيت ، ثم زلة الغطاء. حاول ألا تدخل فقاعات الهواء.

قم بتخزين الشرائح بشكل مسطح في دفتر شرائح عند أربع درجات مئوية لمدة يوم إلى يومين للسماح لزلات الغلاف بالاستقرار قبل تصوير العينات. فيما يلي بعض النتائج التمثيلية لمقايسات تلطيخ Mount Immunos بالكامل ومقايسات تدفق الإلحاق. الصورة الأولى عبارة عن عرض منخفض الطاقة لبقعة تثبيت كاملة للكوتين المزدوج ، وهي علامة على الخلايا العصبية توضح شبكة سلاسل الخلايا العصبية الشابة المهاجرة في المنطقة تحت البطينية البالغة.

التالي هو عرض آخر منخفض الطاقة لحامل ثقب تم تلطيخه ل KI 67 باللون الأخضر والأوعية الدموية باللون الأحمر ، مما يوضح التفاعل الوثيق الموصوف مؤخرا بين الخلايا المنقسمة والأوعية الدموية في المنطقة تحت البطينية بقوة أعلى. تظهر الصورة التالية صورة متحدة البؤر لسطح البطين مع السطح القمي للخلايا المبطنة للبطين الذي حدده بيتا كاتين في تلطيخ باللون الأخضر والأجسام القاعدية لتلك الخلايا المسماة ب جاما توبولين باللون الأحمر. الصورة النهائية عالية الطاقة هي إسقاط أقصى لكومة متحدة البؤر مأخوذة من صبغة تثبيت كاملة ل GFAP تظهر الألياف القاعدية الطويلة الموجبة GFAP لخلايا S vz من النوع B لتحليل تدفق السائل الدماغي النخاعي واتجاهه وسرعته على سطح البطين.

يمكن دمج الإطارات المتتالية من أفلام تدفق الإلحاق في صورة مركبة واحدة. تظهر هذه الصور المركبة موضع الخرزات المفردة في نقاط زمنية مختلفة أثناء عبورها الملحق أو السطح. فيما يلي مثال على كيفية ظهور النتائج عند اكتمالها.

لقد رأيت للتو كيفية تحضير حوامل كاملة من المنطقة تحت البطين للجدار الجانبي للبطين الجانبي. يوفر هذا رؤية كاملة للجدار بأكمله وقد سمح بالعديد من الاكتشافات على مر السنين ، بما في ذلك ملاحظة أن هذا البطين يتم تنظيمه كشبكة من المسارات للهجرة المتسلسلة. كما سمح لنا بدراسة كيفية تدفق سائل لوحة الخدمة هذا فوق هذا الجدار ، كما اقترح بشكل غير مباشر طرقا توجه بها هذه الخلايا هجرتها عبر هذه الشبكة الواسعة جدا من المسارات.

في الآونة الأخيرة ، سمحت لنا هذه التقنية باكتشاف أن البطين الفرعي يتم تنظيمه كعجلات دبوس مع الخلايا الجذعية في قلب عجلات الدبوس هذه التي تكشف عن النهاية البصرية للخلايا الجذعية داخل هذا الهيكل. نظرا لأن الحامل بأكمله يسمح بمنظور كامل لهذه المنطقة البطينية ، فإنه يوفر عرضا لا توفره الأقسام ، ولهذا السبب ، فإننا نجعله متاحا للجميع لأنه يجب أن يكون مفيدا للعديد من الدراسات الأخرى. هناك بعض المفاتيح التي يجب تذكرها عند إعداد حوامل الثقب التي من شأنها تحسين التشريح.

الأول هو الحصول على إضاءة مناسبة لضبط الإضاءة لإلقاء الظلال على حامل الفتحة. سيوفر ذلك تباينا ويوضح لك المكان الذي يجب أن تقوم فيه بالتخفيضات. والثاني هو استخدام الملقط كدبابيس متنقلة.

لا تريد استخدام الملقط للضغط على الأنسجة أو رفع الأنسجة. بدلا من ذلك ، استخدمهما كدبابيس متنقلة تؤمن الأنسجة أثناء القطع. والثالث هو استخدام مزيج من التراجع العام والقطع.

كما تلاحظ في التشريح ، يتم إجراء القليل جدا من قطع الأنسجة. يتم إجراء معظم عمليات التشريح عن طريق التراجع العام خلال الجولة الثانية من التشريح. عندما تقوم بخلع الجدار الجانبي من ما تبقى من الحامل بأكمله.

أهم شيء هو توجيه الجروح في مستوى مواز لمستوى سطح البطين. سيضمن ذلك أن لديك سماكة واحدة من الأمام إلى الخلفي على طول الجدار الجانبي. وسيضمن ذلك أيضا أنه عندما تقوم بالتصوير متحد البؤر عالي الدقة ، سيكون لديك صور يتم التركيز عليها جميعا في مستوى واحد.

نأمل أن يكون هذا الفيديو مفيدا لك في دراستك. حظا سعيدا في تجاربك.