Name: Préparation du tissu cérébral de souris pour microscopie électronique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-20T17:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Apprenez la préparation du tissu cérébral de souris pour microscopie électronique immuno. Cette méthode combine perfusion transcardiaque, immunohistochimie et coupes ultrafines pour visualiser la distribution protéique à haute résolution.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions Shao-Ming Lu et Harris A. Gelbard pour l&#39;utilisation d&#39;une pompe péristaltique et vibratome, ainsi que Karen L. Bentley et Gayle Schneider au Core Facility microscope électronique à la recherche de l&#39;Université de Rochester Medical Center de l&#39;assistance technique. Ce travail a été financé par des subventions du NIH (EY019277), Whitehall Fondation Burroughs Wellcome Fund et la Fondation Alfred P. Sloan pour AKM. M.-È.T. est financé par un Fonds de recherche en santé du Québec (FRSQ) de bourses de formation postdoctorale.

1. Perfusion des animaux <ol><li> Le jour avant la perfusion, préparer: - 2 L de tampon phosphate (PB; 100 mM, pH 7,4) et 1 L de sodium tampon phosphate salin (PBS, 0,9% de NaCl dans 50 mM de PB, pH 7,4) dans de l'eau bidistillée. Stocker le PBS et 1L de PB à 4 ° C. Ils seront utilisés pour la perfusion et de pré-enrobage immunocytochimie. - 1L de 4,0% paraformaldéhyde (PFA, pH 7,4) la solution de fixation, ce qui permettra à la perfusion de 6 souris. À cette fin, la chaleur jusqu'à 1 L de PB sous une hotte. Peser 40 g de paraformaldéhyde granulaire (PFA) et verser dans la solution PB quand elle atteint 60 ° C. Quand la solution est claire, avec l'IFP complètement dissous, refroidir à température ambiante (RT) et stocker à 4 ° C. </li><li> Le jour de la perfusion, préparer 500 ml de solution d'acroléine de 3,5% en PB sous une hotte. Ensuite, filtrer les 3,5% d'acroléine et de 4,0% en utilisant des solutions PFA papier filtre. </li><li> Pour l'anesthésie de la souris, injecter du pentobarbital sodique (80 mg / kg) dans le péritoine avec une jauge de 27 ½ "aiguille. </li><li> Pendant la perfusion, 50 ml de PBS, 75 ml d'acroléine, et 150 ml de PFA seront séquentielle passent dans la circulation de la souris. Pour configurer la pompe péristaltique, remplir le tube avec du PBS et de fixer une jauge 23 ¾ "aiguille à ailettes à une extrémité. Plongez l'autre extrémité du tube dans la solution de perfusion (PBS, l'acroléine ou PFA). Régler la vitesse de la péristaltique Pompe à 20-25 ml / min pour les souris adultes et juvéniles. Tout au long de la perfusion, soigneusement éviter toute formation de bulles d'air dans le tube. </li><li> Attendez jusqu'à ce que la souris anesthésiée ne répond plus aux stimuli douloureux, comme un pincement de la queue, avant de procéder. Lay de l'animal dans un bac de dissection et de fixer les pattes avec du ruban. Avec une pince à épiler, ciseaux, ouvrir la peau et la cavité thoracique afin d'exposer le cœur. Afin de minimiser l'ischémie cérébrale, la perfusion doit être lancé rapidement. Couper l'oreillette droite avec de petits ciseaux et de démarrer la pompe péristaltique. Tout en maintenant le cœur avec des pincettes, insérer l'aiguille papillon dans la pointe du ventricule gauche. </li><li> Lors du changement de solution, arrêter la pompe péristaltique, le transfert du tube d'une solution à l'autre, et de redémarrer la pompe immédiatement. </li><li> Lorsque 150 ml de PFA est passé, arrêter la pompe péristaltique. L'utilisation de petits ciseaux, couper la tête, ouvrez la peau, et de briser le crâne entre les yeux. Utiliser des petites pinces, soigneusement puce petits morceaux de crâne jusqu'à ce que le cerveau peut être facilement enlevés. Post-fix du cerveau pendant 2 heures à 4 ° C en PFA. Lavez 3 fois 10 minutes dans du PBS. </li><li> La coupure immédiate du cerveau dans transversale (50 sections um d'épaisseur) dans la glace refroidi par PBS en utilisant un vibratome. Avec un pinceau fin, le transfert des sections choisies pour immunocytochimie dans un flacon en verre contenant du PBS. Stocker les sections restantes à -20 ° C dans un cryoprotecteur (30% d'éthylène glycol et du glycérol 30% dans PBS) pendant jusqu'à plusieurs années. </li></ol> 2. Pré-enrobage immunocytochimie <ol><li> Pour l'immunocytochimie, les sections sont traitées flottant librement dans des flacons en verre. Tout au long de la procédure, on doit soigneusement éviter de laisser sécher les sections. </li><li> Tout d'abord, retirer le CPE à l'aide d'une pipette de transfert et de remplacer immédiatement avec une solution fraîche de borohydrure de sodium à 0,1% dans PBS pendant 30 minutes à température ambiante. </li><li> Rincer avec du PBS sections 3 fois 10 minutes, enlever toutes les bulles, et incuber pendant 2 heures à température ambiante dans une solution de blocage de PBS contenant 0,5% de gélatine et de 5% de sérum normal de l'animal dans lequel l'anticorps secondaire a été généré (sérum de chèvre normal dans le présent exemple de Iba1-immunomarquage). </li><li> Incuber pendant 48 heures avec l'anticorps primaire dans une solution de blocage. Pour Iba1-immunomarquage, l'utilisation de lapin anti-Iba1 d'anticorps (1:1000). </li><li> Rincer avec du PBS sections 3 fois 10 minutes et incuber en anticorps secondaire conjugué à la biotine (1:1000) dans une solution de blocage pendant 2 heures à température ambiante. Pour Iba1-immunomarquage, l'utilisation de chèvre anti-IgG de lapin. </li><li> Rincer avec du PBS sections 3 fois 10 minutes et incuber dans streptavidine-peroxydase de raifort (1:1000) dans une solution de blocage pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Rincer avec du PBS sections 10 minutes et avec du Tris / HCl solution saline tamponnée (SCT; 50 mM, pH 7,4) 2 fois 10 minutes. Pour révéler l'étiquetage, incuber sections avec DAB 0,05% et 0,01% de peroxyde d'hydrogène dans du TBS (solution fraîchement préparée). Lorsque la coloration est brun foncé (voir exemple en figure 1), arrêter la réaction en rinçant au SCT. En tout cas, la fin de la réaction après un maximum de 5 minutes. Rincer les sections avec le SCT 10 minutes et avec PB 2 fois 10 minutes. </li></ol> 3. Traitement pour la microscopie électronique <ol><li> Transfert sections en PB dans une plaque de culture multipuits en utilisant un pinceau fin. Préparer une solution de tétroxyde d'osmium% de PB sous une hotte fumant. Retirer PB provenant des puits de la plaque de culture et répandre les sections planes avec un pinceau fin. Immédiatement sections plonger dans osmium à 1% pendant 30 minutes à température ambiante. </li><li> Transfert des sections dans des flacons en verre, rincez avec PB 3 fois 10 minutes, et déshydrater grâce à des immersions dans les deux minutes ascendante concentrations d'éthanol: 2 fois 35%, une fois chacun de 50%, 70%, 80%, 90%, et 95 %, 3 fois à 100%, suivie par l'oxyde de propylène 3 fois. </li><li> Pour préparer la résine Durcupan, mélanger 20 g de composant A, 20 g de composant B, 0,6 g de composant C, et 0,4 g du composant D dans un bécher jetable, bien mélanger jusqu'à ce que la couleur devient uniforme, et versez-le dans une boîte en aluminium pèsent plat. Si nécessaire, des blocs de résine peuvent être préparés par coulage de résine dans les moules et les intégrer dans un four de séchage à 55 ° C pendant 48-72 heures. </li><li> Utiliser une brosse fine rincés à l'oxyde de propylène, enlever les sections de l'oxyde de propylène et plonger dans la résine d'imprégnation Durcupan nuit à TA. </li><li> Le lendemain, mettre de l'aluminium pèsent plat dans un four à 55 ° C pendant 10 minutes pour ramollir la résine. Avec un pinceau rincés à l'oxyde de propylène, le manteau d'un film intégrant ACLAR avec une fine couche de résine, de fixer les sections, couvrir avec un autre film d'enrobage, et à répartir uniformément les poids légers (environ 2 g, par exemple les bouchons en plastique des flacons en verre) sur le dessus pour aider à répandre la résine. Pour la polymérisation de résine, incuber dans le four pendant 48-72 heures (à 55 ° C). </li><li> Après polymérisation, enlever les poids légers et le film intégrant sur le dessus des sections. Sous un microscope binoculaire, sélectionner des zones d'intérêt carrés (environ 2x2 mm) et soigneusement les exciser du film en utilisant une lame de rasoir. </li><li> Collez les domaines d'intérêt, à la pointe de blocs de résine à l'aide Superglue et guérir dans le four à 55 ° C pendant 1 heure. </li><li> En préparation pour la coupe, coupez le bloc de résine à la forme d'un trapèze isocèle avec une lame de rasoir. </li><li> Utiliser un ultramicrotome et un couteau de verre, enlever la colle et la résine à la surface du tissu. Remplissez le bateau du couteau en verre avec de l'eau bidistillée et couper quelques coupes semi-fines (0,5-1 um d'épaisseur). </li><li> Transfert des sections à une diapositive SuperFrost avec une boucle parfaite. Sécher les sections en plaçant la lame sur une plaque chauffante à 80 ° C pendant 1 minute. Couvrir avec quelques gouttes de bleu de toluidine 0,1% tache (2 g de borate de sodium et 0,2 g de bleu de toluidine dans 200 ml d'eau bidistillée) pendant 1 minute. Rincez la tache avec de l'excès d'eau bidistillée. L'examen des parties avec un microscope optique permettra de distinguer les tissus colorés de la résine (figure 2). </li><li> Reprendre la coupe jusqu'à la frontière entre le tissu et la résine atteint le milieu des sections. Notez que la procédure suivante nécessite une formation. Remplacer le couteau en verre avec un couteau de diamant et de remplir le bateau à l'eau bidistillée. Couper l'argent à des coupes ultrafines argent-or (60-80 nm d'épaisseur) et soigneusement les recueillir sur les grilles de mailles fines cuivre en utilisant une pince à épiler inversé. Sécher les grilles sur un papier filtre. </li><li> Pour améliorer le contraste, coupes ultrafines peuvent être colorées avec du citrate de plomb (0,03 g citrate de plomb et 0,1 ml d'hydroxyde de sodium 10N dans 10 ml d'eau bidistillée 1). En utilisant une pince à épiler fines inversé, le transfert d'une grille à une baisse de citrate de plomb pendant 2 minutes. Retirez délicatement la grille et rincer à trois bains successifs d'eau bidistillée. Enfin, sécher les grilles sur un papier filtre et rangez-les dans une boîte de grille jusqu'à examen au microscope électronique (Figures 3-6). </li></ol> 4. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Iba1 teinté section au niveau de lumière microscopiques. La distribution cellulaire des Iba1 est limitée à la microglie, qui montre la spécificité de l'immunomarquage. Barre d'échelle = 100 pm. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Toluidine colorées en bleu semi-fines section au niveau de lumière microscopiques. Notez la frontière entre le tissu et résine où l'immunomarquage apparaîtra plus intense au microscope électronique. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Section ultrafine montrant Iba1-immunopositives péricaryon microgliales et les processus au niveau microscope électronique. Iba1 positifs des éléments de structure sont reconnus par leurs immunoperoxydase-DAB denses aux électrons précipité. Barre d'échelle = 2 um. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Ultrathin la section affichant Iba1-immunopositives processus microgliales de tailles et de formes différentes au niveau microscope électronique. Barre d'échelle = 2 um. e 5 "/&gt; Figure 5. Ultraminces montrant la section au plus fort grossissement d'un processus positif Iba1 microgliales de la figure 4, permettant l'identification de ses organites intracellulaires. Barre d'échelle = 1 um. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig6.jpg" alt="Figure 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 6"> Figure 6. Section ultrafine révélant au plus fort grossissement les relations entre un processus ultrastructurale Iba1 positif microgliales et des éléments proches du neuropile dont les synapses. Barre d'échelle = 1 um.

<ol><li>Venable, J. H., Coggeshall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+lead+citrate+stain+for+use+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).</li>
<li>Riad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatodendritic+localization+of+5-HT1A+and+preterminal+axonal+localization+of+5-HT1B+serotonin+receptors+in+adult+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain.</a> J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).</li>
<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+EphA4+in+axon+terminals+and+dendritic+spines+of+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).</li>
<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+course+of+EphA4+cellular+and+subcellular+localization+in+the+postnatal+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).</li>
<li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-synaptic+and+post-synaptic+localization+of+EphA4+and+EphB2+in+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain.</a> J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).</li>
<li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA4+is+localized+in+clathrin-coated+and+synaptic+vesicles+in+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain.</a> J Neurochem. , (2010).</li>
</ol>

Ici, nous avons décrit un protocole de préparation de tissu cérébral de souris pour immunoélectromicroscopie qui offre un excellent compromis entre la préservation ultrastructurale et la détection optimales immunocytochimiques, lorsque les procédures sont rigoureusement exécutée. Combiné avec la TEM, cette méthode permet de distinguer les éléments cellulaires avec peu de traits distinctifs et les critères d&#39;identification. En particulier, la coloration immunoperoxydase-DAB du Iba1 permet...

* On doit toujours travailler sous une hotte et porter des gants en nitrile lorsque vous manipulez l&#39;acroléine, le paraformaldéhyde, et l&#39;osmium et devrait également disposer de leurs déchets de façon appropriée.

préparation du tissu cérébral de souris pour microscopie électronique

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Microscopie électronique à transmission (MET) est extrêmement utile pour la visualisation de la microglie, oligodendrogliome, astrocytaire, et neuronale compartiments subcellulaires (dendrites, épines dendritiques, axone, axone terminal, péricaryon), ainsi que leurs organites intracellulaires et du cytosquelette, dans le système nerveux central à haute résolution spatiale. Combiné avec la TEM, pré-enrobage immunocytochimie permet la discrimination des éléments cellulaires avec peu de traits distinctifs et les critères d&#39;identification (par exemple, microgliales péricaryon et des processus, en utilisant un anticorps dirigé contre le marqueur spécifique à la microglie Iba1 (ionisé molécule adaptatrice une fixation du calcium; tel que présenté ici)), en identifiant le contenu neurotransmetteur des éléments cellulaires (par exemple, sérotoninergiques) et leur localisation ultrastructurale des protéines solubles ou membranaires (par exemple, 5 HT1A et EphA4 récepteurs). Ici, nous décrivons un protocole pour perfusion transcardiaque de souris avec l&#39;acroléine fixateur, l&#39;enlèvement et le sectionnement du cerveau, ainsi que l&#39;immunoperoxydase-diaminobenzidine (DAB) coloration, résine d&#39;enrobage, et ultraminces de sectionnement des sections du cerveau. A l&#39;issue de ces procédures, le matériel est prêt immunocolorés pour examen avec le TEM. Lorsque rigoureusement exécutée, cette technique fournit un excellent compromis entre la préservation ultrastructurale et la détection optimales immunocytochimiques.

Nous décrivons un protocole pour perfusion transcardiaque de souris, l&#39;enlèvement et la coupe du cerveau, ainsi que la coloration immunoperoxydase, résine d&#39;enrobage, et ultraminces de sectionnement des sections du cerveau. A l&#39;issue de ces procédures, le matériel est prêt pour immunocolorés examen par microscopie électronique à transmission.

Préparation du tissu cérébral de souris pour microscopie électronique

La microscopie électronique à transmission (MET) est extrêmement utile pour visualiser les compartiments subcellulaires microgliaux, oligodendrocytes, astrocytaires et neuronaux...

L'objectif général de cette procédure est de préparer le tissu cérébral de souris pour la microscopie électronique immunocytochimique. Cela est réalisé en fixant d'abord le cerveau par perfusion de l'animal. La deuxième étape de la procédure consiste à découper le cerveau et à traiter les sections pour l'immunohistochimie.La troisième étape de la procédure consiste à décalcifier, déshydrater et inclure les sections. La dernière étape de la procédure est de couper des sections ultraminces. En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant, avec une haute résolution spatiale, la distribution de diverses protéines au sein de différentes régions et types cellulaires du système nerveux central.Bonjour, je suis Maria Trombley du laboratoire d'Esca, du département de neurobiologie et d'anatomie de l'Université de Rochester. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de préparation du tissu cérébral de souris pour la microscopie électronique immunocytochimique. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les interactions entre les microglies et les synapses au cours du développement, de la plasticité dépendante de l'expérience et du vieillissement.Commençons. Après avoir fixé le cerveau de la souris par perfusion intracardiaque post mortem, post-fixez-le dans environ 10 millilitres de formaldéhyde à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Lavez le cerveau à quatre degrés Celsius, dans du 1 XPBS, trois fois pendant 10 minutes à chaque lavage, en utilisant un vortex et du 1 XPBS glacé, puis découpez immédiatement le cerveau en sections transversales de 50 micromètres.Utilisez un pinceau fin pour transférer les sections sélectionnées dans un flacon en verre rempli de PBS à quatre degrés Celsius. Conservez les sections restantes dans un cryoprotecteur à moins 20 degrés Celsius pendant plusieurs années sans altération. Traitez au maximum 10 sections libres pour la coloration dans chaque flacon en verre.Utilisez une pipette de transfert pour remplacer le PBS X par du borohydrure de sodium à 0,1 % frais dans du PBS. Changez rapidement les solutions afin d'éviter que les sections ne s'assèchent. Incubez pendant 30 minutes, rincez les sections avec du PBS X trois fois pendant 10 minutes chacune. Veillez à éliminer toutes les bulles et bloquez avec du PBS X contenant 0,5 % de gélatine et 5 % de sérum normal, adapté à l'anticorps secondaire qui sera utilisé.Incuber pendant deux heures. Ajouter l'anticorps primaire dilué dans la solution de blocage. Incuber pendant 48 heures.Rincer avec un XPB S3 fois pendant 10 minutes. Incuber chaque fois avec un anticorps secondaire marqué à la biotine dilué dans la solution de blocage pendant deux heures. Rincer trois fois 10 minutes dans un XPBS comme précédemment.Incuber avec de la streptavidine peroxydase diluée dans la solution de blocage pendant une heure. Rincer les sections une fois dans du PBST 1X et deux fois dans du TBST 1X pendant 10 minutes chacun. Pour révéler le marquage, incuber les sections avec une solution fraîchement préparée contenant 0,05 % de DAB et 0,01 % de peroxyde d'hydrogène dans du TBST 1X.Lorsque la coloration est visiblement brun foncé ou que la réaction a duré cinq minutes, rincez les sections avec un XTBS pour arrêter la réaction. Rincez ensuite une fois avec un XTBS et deux fois avec un x PB pendant 10 minutes chacun. Dans une hotte, utilisez un pinceau fin pour transférer les sections dans une plaque de culture multipuits remplie d’un XPB.Retirer le PB d'un puits à l'aide d'un pinceau fin pour étaler immédiatement les sections à plat. Ajouter une solution d'osmium tétraoxyde à 1 % dans un PB avant de passer au puits suivant, puis incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Transférer les sections d'OSM dans des vials en verre.Rincer avec un XPB trois fois pendant 10 minutes. Déshydrater les sections dans des concentrations croissantes d'éthanol. Ensuite, utiliser l'oxyde de propylène comme décrit dans la partie textuelle de ce protocole.Utilisez un pinceau fin rincé dans de l'oxyde de propylène pour transférer les sections dans une résine dupant fraîchement préparée. Pour l'impregnation pendant la nuit, placez la boîte contenant les sections dans une étuve à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes. Pour ramollir la résine, utilisez un pinceau rincé avec de l'oxyde de propylène afin d'enduire une pellicule d'inclusion en chlor d'une fine couche de résine.Transférez la section sur le film et recouvrez-la uniformément d'un autre film d'inclusion. Répartissez des poids légers d'environ deux grammes sur le dessus pour aider la résine à s'étaler. Laissez la résine polymériser à 55 degrés Celsius pendant 48 à 72 heures dans un incubateur. Après polymérisation, retirez les poids dans la couche supérieure du film d'inclusion sous un microscope binoculaire.Sélectionnez des zones d’intérêt de deux millimètres sur deux millimètres et utilisez une lame de rasoir pour les exciser du film. Collez les zones d’intérêt sur les extrémités de blocs de résine à l’aide de Super Glue. Incubez une heure dans un four à 55 degrés Celsius.Utilisez une lame de rasoir pour tailler le bloc de résine en forme de trapèze isocèle, la forme optimale pour l'aspiration ultrafine. À l'aide d'un microtome et d'un couteau en verre, retirez la colle à la surface du tissu afin d'obtenir une surface plane. Pour l'aspiration.Remplissez la cuve du couteau en verre avec de l’eau doublement distillée et coupez quelques sections comprises entre 0,5 et un micron. Utilisez une boucle parfaite pour transférer les sections sur une lame Super Frost. Séchez pendant une minute sur une plaque chauffante à 80 degrés Celsius et coloriez avec du bleu de toluidine 0,1 % pendant une minute.Utilisez une bouteille pulvérisatrice pour rincer l'excès de colorant à l'eau doublement distillée. Au microscope optique, examinez les sections afin de distinguer le tissu coloré de la résine. Coupez des sections semi-minces jusqu'à ce que la limite entre le tissu et la résine atteigne approximativement le milieu de la section. Remplacez le couteau en verre par un couteau en diamant et remplissez le bac avec de l'eau doublement distillée.Couper l'argent en tranches ultrafines allant de l'argent à l'or. Réaliser des sections de 60 à 80 nanomètres d'épaisseur. Utiliser des pinces fines inversées pour prélever soigneusement les sections sur des grilles en cuivre à mailles. Séchez les grilles sur du papier filtre pour améliorer le contraste. Utilisez des pinces fines inversées pour transférer une grille dans une goutte de citrate de plomb pendant deux minutes. Rincez délicatement la grille en l'immergeant dans trois bains successifs d'eau doublement distillée.Séchez la grille sur du papier filtre et rangez-la dans une boîte à grilles pour un examen ultérieur au microscope électronique. Examinez les grilles au microscope électronique afin de visualiser la coloration immunohistochimique, mais aussi la morphologie des éléments cellulaires, leurs organites intracellulaires et leurs relations mutuelles.Ici, une immunomarquage représentatif pour IBA one est montré au niveau microscopique optique. La distribution cellulaire de IBA one est limitée aux microglies, ce qui confirme sa spécificité au niveau microscopique électronique. Les microglies marquées immunologiquement pour IBA one, ainsi que leurs périkaryons et leurs prolongements, sont visibles.La coloration immunoperoxydase au DAB apparaît sous forme d'un précipité électrodense. D'autres exemples d'IBA un, de prolongements microgliaux immunomarqués, présentent des tailles et des formes variées. Un grossissement plus élevé révèle divers organites intracellulaires à l'intérieur d'un des prolongements microgliaux, ainsi que les relations ultrastructurales entre un autre prolongement microglial et des éléments voisins du neuropil, notamment des synapses.Nous venons de vous montrer comment préparer le tissu cérébral de souris pour la microscopie électronique immunocytochimique. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de suivre rigoureusement toutes les étapes et de manipuler délicatement le tissu cérébral. Voilà donc tout ce qu'il faut savoir.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

preparation-of-mouse-brain-tissue-for-immunoelectron-microscopy

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Cette vidéo démontre la coloration immunohistochimique des fibres cholinergiques dans le noyau basal de la région de Meynert de coupes de cerveau de souris. Les sections sont bloquées et traitées avec de l’acétyltransférase primaire contre la choline, suivie d’anticorps secondaires biotinylés. Des complexes avidine-biotine-peroxydase sont ajoutés, qui se lient aux anticorps secondaires, puis au substrat chromogène. Les coupes sont ensuite déshydratées et montées avant d’être visualisées au...

Coloration immunohistochimique des fibres nerveuses dans le noyau basal de Meyner du cerveau de souris

Source : Kummari, E., et. al., Microdissection par capture laser - Une démonstration de l’isolement des neurones dopaminergiques individuels et de l’ensemble de l’aire tegmentale ventrale., J. Vis. Exp. (2015)Dans cette vidéo, nous démontrons le protocole d’immunohistochimie pour les neurones dopaminergiques dans les coupes de tissus cérébraux pour la microdissection ultérieure par capture laser.

Immunohistochimie de coupes de tissu cérébral de souris pour cibler les neurones dopaminergiques

Source : Schönherr, S., et. al. Immunomarquage combiné de l’optogénétique et de la réplique de congélation-fracture pour examiner l’arrangement spécifique à l’entrée des récepteurs du glutamate dans l’amygdale de la souris. J. vis. exp. (2016)Cette vidéo démontre l’immunomarquage de répliques de tissu cérébral de souris fracturées par congélation pour la microscopie électronique. Les répliques fracturées et enrobées sont digérées pour exposer les récepteurs. Des anticorps primaires et...

Immunomarquage de protéines membranaires neuronales dans un échantillon de tissu cérébral de souris fracturé par congélation

Source : Louth, E. L.,  et al. Imagerie de neurones dans des sections cérébrales épaisses à l’aide de la méthode Golgi-Cox. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo montre l’imagerie des neurones dans une section de cerveau épaisse colorée par Golgi-Cox en définissant des limites de mise au point supérieure et inférieure et en capturant des images qui se chevauchent. Plusieurs emplacements sont imagés pour assurer des projections neuronales détaillées, qui sont combinées pour créer une représentation 3D.

Imagerie microscopique de neurones dans une section de cerveau de souris à l’aide d’une coloration métallique de Golgi-Cox

Dans cet article, nous décrivons la procédure expérimentale complète de reconstruire, avec une haute résolution, le cerveau anatomie amende de cerveaux de souris marqués par fluorescence. Le protocole décrit comprend la préparation de l'échantillon et de la compensation, spécimen de montage pour l'imagerie, les données de post-traitement et de visualisation multi-échelle.

Résolution tomographie optique de cerveaux de souris entières avec Feuille confocale microscopie optique Micron-échelle de

Ici, nous offrons un moyen facile, peu coûteuse et efficace protocole temps pour fixer chimiquement le tissu cérébral des primates avec acroléine fixatif, permettant la conservation à long terme qui est compatible avec l'immunohistochimie pré-enrobage pour la microscopie électronique à transmission.

Préparation du Primat tissu cérébral non humain pour immunohistochimie pré-enrobage et microscopie électronique

Nous décrivons ici une approche quantitative pour déterminer la répartition d’une protéine synaptique par rapport à une protéine de marqueur à l’aide d’immunofluorescence souillant, microscopie confocale et analyse assistée par ordinateur.

Quantifier la répartition hétérogène d’une protéine synaptique dans le cerveau de souris à l’aide d’Immunofluorescence

Ce rapport décrit des méthodes complètes pour préparer les sections congelées de rétine de souris pour l'immunohistochimie (IHC).  Les méthodes décrites incluent la dissection de la tasse postérieure oculaire, la fixation de paraformaldehyde, l'intégration dans la température de coupe optimale (OCT) orientation de médias et de tissu, sectionnement et immunostaining.

Préparation de la souris Retinal Cryo-sections pour l'immunohistochimie

Ce protocole décrit une méthode permettant de combiner l’hybridation in situ par fluorescence (FISH) et l’immunohistochimie par fluorescence (IHC) dans des coupes de cerveau de souris fraîches, congelées et fixes, dans le but d’obtenir un signal FISH et IHC de fluorescence multimarqueur. L’IHC a ciblé les protéines cytoplasmiques et membranaires.

Combinaison de l’hybridation in situ par fluorescence multiplex avec l’immunohistochimie fluorescente sur des coupes de cerveau de souris fraîches, congelées ou fixes

Ce protocole décrit une approche efficace et reproductible pour les études histologiques du cerveau de souris, y compris la perfusion, la section du cerveau, l’immunocoloration flottante, le montage tissulaire et l’imagerie.

Immunocoloration flottante libre du cerveau des souris

La capacité de marquer de façon permanente les cellules souches et leur descendance avec un fluorophore à l’aide d’une lignée transgénique inductible traçant la lignée de souris permet une analyse spatiale et temporelle de l’activation, de la prolifération, de la migration et / ou de la différenciation in vivo. Le traçage de la lignée peut révéler de nouvelles informations sur l’engagement de la lignée, la réponse aux interventions et la multipotence.

Traçage de la lignée des cellules souches inductibles marquées par fluorescence dans le cerveau de souris adulte

Apprenez la préparation du tissu cérébral de souris pour microscopie électronique immuno. Cette méthode combine perfusion transcardiaque, immunohistochimie et coupes ultrafines pour visualiser la distribution protéique à haute résolution.

Préparation du tissu cérébral de souris pour microscopie électronique

Explorer plus de vidéos