Мышиных эмбриональных легких культуры, системы оценки Молекулярные механизмы Ветвление

В этом видео демонстрируется метод вскрытия и культивирования эмбриональных легких мыши. Процедура начинается с забора эмбрионов в точке Е 11,5 или Е 12,5. Затем эмбрионы вскрываются и извлекаются легкие.

Затем легкие помещают в интерфейс жидкого воздуха и инкубируют после посева. Изменения в росте и разветвлении мезенчи и эпителия эмбрионального легкого в ответ на специфические методы лечения можно наблюдать с помощью стереомикроскопа. Здравствуйте, я Дэвид Уор Бертон.

Я руковожу программой биологии развития и регенеративной медицины в детской больнице Научно-исследовательского института Бан в Лос-Анджелесе. Я Ян Карро, старший постдок в лаборатории доктора Вара Бертона. Сегодня мы покажем вам методику выделения эмбриональных легких мыши и помещения их в культуру органов.

Эта техника развилась из оригинального описания Тины Джако Халкин и Пабло в Школе стоматологии Университета Южной Калифорнии около 20 лет назад. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения морфии ветвления ягнят. Итак, приступим.

На 11,5-й или 12,5-й день поместите беременную мышь, принесенную в жертву углекислым газом, под колпак для ламинарного потока на ее спине. Сбрызните 70% этанолом. Сделайте надрез в области живота.

Затем, удерживая животное за задние лапы, снимите кожу, потянув вверх. Откройте брюшную полость и удалите матку. Поместите матку в коническую трубку объемом 50 миллилитров, наполненную холодным раствором сбалансированной соли Ганкса или HBSS и осторожно покачивайте в течение двух минут, чтобы смыть кровь.

Далее перенести матку в чашку Петри под стереоскопическим препарирующим микроскопом. С помощью пружинных ножниц разрежьте стенку матки, чтобы выпустить эмбрионы. Затем с помощью перфорированной ложки соберите эмбрионы и поместите их в чашку Петри, содержащую HBSS, и положите на лед.

Продолжайте работу под стереоскопическим препарирующим микроскопом и приступайте к вскрытию эмбриональных легких. Начните с того, что поместите эмбрион на левый бок. С помощью щипцов снимите правую переднюю конечность, держащую щипцы в левой руке.

Разрежьте эмбрион, начиная с отверстия конечности, и удалите кожу. Этот шаг позволит увидеть внутренние органы и локализовать сердце и легкие для следующего этапа. Удалите сердце.

Эмбриональные легкие расположены позади сердца и спереди от позвоночника. Далее отделите неповрежденное легкое от эмбриона. Затем обрежьте посторонние ткани и пищевод.

После того, как легкие будут удалены, используйте стерильную передаточную пипетку, чтобы перенести их в чашку Петри, содержащую холодный HBSS на льду. В каждую лунку без клона дельта полистирола добавляют от 0,5 до одного миллилитра D-M-E-M-F 12 с добавлением 50 ЕД на миллилитр пенициллина стрептомицина. Затем поместите мембрану для травления на основе нуклеополикарбоната поверх носителя блестящей стороной вниз и шероховатой стороной вверх.

С помощью стерильной пипетки для переноса поместите рассеченное эмбриональное легкое поверх мембраны из ядра поликарбоната. С помощью стереомикроскопа отрегулируйте положение легких эмбриона. Эмбриональное легкое должно иметь неповрежденную трахею, расположенную в прямом положении, как показано здесь.

Это гарантирует, что все легкие имеют одинаковое внутреннее давление, переносят чашку в клеточный инкубатор и культивируют в течение нужного времени. Здесь легкие Е 12.5 выращивали в присутствии или в отсутствие FGF 9. FGF nine является членом семейства факторов роста фибробластов, которые индуцируют расширение мехи и расширение эпителия в легких, выращенных in vitro через 48 часов.

При отсутствии FGF 9 наблюдается повышенное ветвление. Эти изображения представляют собой фотографии эмбрионального легкого, сделанные под стереомикроскопом. Напротив, легкие, выращенные за 48 часов в присутствии FGF 9, имеют расширенный эпителий и мехи.

После 24 часов посева. Через 48 часов воздействие на эпителий становится еще более выраженным. Итак, мы только что показали вам, как приготовить культуры органов из эмбрионального легкого мыши.

При проведении этой процедуры важно помнить о необходимости как можно скорее удалить легкое из эмбриона, чтобы уменьшить ухудшение тканей. Так что спасибо за просмотр. Надеюсь, вы найдете этот метод полезным.

Удачи в ваших экспериментах.