Toxoplasma gondii Formação parede do cisto no Activated derivadas da medula óssea macrófagos e Condições Bradyzoite
12 de agosto de 2010
Toxoplasma gondii se converte em uma forma de cisto em resposta ao estresse ambiental, que pode ser imitada em modelos de cultura de tecidos. Este vídeo demonstra técnicas para examinar a formação de parede do cisto, ativando derivadas da medula óssea macrófagos ou alterar o pH de crescimento médio em células de fibroblastos.
O objetivo geral deste procedimento é induzir e visualizar a formação da parede do cisto em Toxoplasma gondii in vitro. Isso é realizado primeiramente cultivando macrófagos e fibroblastos.
Em seguida, ao infectar essas células hospedeiras com o parasita, as respostas ao estresse podem ser induzidas no gde olho por meio do choque dos fibroblastos com pH ou da ativação dos macrófagos, o que levará à formação da parede do cisto. Por fim, uma lectina fluorescente é adicionada às culturas, a qual se liga à parede do cisto, permitindo que o cisto seja visualizado por microscopia de imunofluorescência. Olá, sou Crystal Tobin do laboratório da Dra. Laura Noel, do Departamento de Microbiologia Médica e Imunologia da Universidade de Wisconsin Madison.
Sou Angela Pollard, também do No Lab. Hoje vamos mostrar a vocês um procedimento para a formação in vitro da parede do cisto de Toxoplasma gondii. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar as respostas do parasita a condições de estresse.
Então vamos começar. Comece colocando uma lamínula estéril redonda de vidro no fundo de cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços para induzir a conversão de Toxoplasma gondii em bradizoítos em fibroblastos humanos de prepúcio sob condições de pH elevado e privação de dióxido de carbono. Inicie com um frasco de 150 centímetros quadrados confluentes de fibroblastos humanos de prepúcio sob uma capela de cultura de tecidos.
Lave o frasco com camada confluinte de fibroblastos da pele humana duas vezes com um XPBS e, em seguida, adicione 2,5 mililitros de tripsina 0,025% EDTA. Incube o frasco a 37 graus Celsius por cinco a 10 minutos. Após a incubação de cinco a 10 minutos, bata no frasco várias vezes para liberar as células da superfície do plástico.
Em seguida, adicione 150 mililitros de meio HFF ou meio de Eagle modificado por delcos suplementado. Utilize o meio para lavar o frasco e coletar as células. Distribua um mililitro de células em cada poço de uma placa de 24 poços com lamínulas, permitindo que as células atinjam confluência a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.
As células estarão então prontas para serem infectadas com o parasita Toxoplasma Gandhi. Sob a capela de cultura de tecidos, infecte um frasco de 25 centímetros quadrados contendo uma camada confluentes de fibroblastos humanos da pele com duas vezes 10 elevado a seis parasitas e incube a 37 graus Celsius até que as células comecem a lisar. Após cerca de dois a três dias, utilize um raspador de células para remover a monocamada de fibroblastos infectados do frasco de cultura de tecidos.
Em seguida, libere os parasitas das células hospedeiras passando a monocamada desprendida por uma agulha de calibre 27. Utilize um hemocitômetro para determinar o número de parasitas no meio e, então, infecte de 10 elevado à quinta potência de parasitas em cada um dos 24 poços de fibroblastos da pele do prepúcio humano confluentes, previamente preparados.
Incube as células por três horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para permitir que os parasitas invadam as células hospedeiras. Prossiga para induzir a conversão dos parasitas para a fase Brady Zeolite. Remova o DMEM dos fibroblastos humanos de prepúcio infectados.
Lave-os com um XPBS e, em seguida, adicione um mililitro de meio de diferenciação. Um meio à base de RPMI sem bicarbonato ajustado a pH oito. Incube as células por três dias a 37 graus Celsius em ar ambiente.
As células estão agora prontas para serem analisadas quanto à presença de Brady zos. A presença de Brady ZOS é determinada usando a lectina marcada com fluorescência docos por meio da glutenina fluorescente ou DBA, que se liga à parede assist de Toxoplasma Gandhi para preparar as células infectadas para a imagem fluorescente. Enxágue os poços três vezes com um XPBS.
Em seguida, fixe as monocamadas celulares com 200 microlitros de formaldeído 3% por 20 minutos. Remova o fixador e lave os poços com um XPBS. Adicione 200 microlitros de glicina 0,1 molar aos poços e deixe repousar por cinco minutos.
Remova a glicina e lave as cavidades com um XPBS para bloquear e permeabilizar as células. Adicione 250 microlitros de solução de bloqueio. Incube as células por 30 minutos.
Remova a solução bloqueadora e enxágue as cavidades com um XPBS. Adicione 50 microlitros de uma diluição de um para 250 de DBA, que foi conjugada à rumina, nas cavidades. Cubra a placa e agite à temperatura ambiente por uma hora em um agitador orbital.
Após a incubação, remova o DBA marcado com fluorescência lavando as lamínulas três vezes com Triton X-100 0,2% em PBS 1X por cinco minutos cada, em um agitador orbital, e, por fim, monte as lamínulas utilizando meio de montagem com proteção beta contendo dpi. A coloração T Gandhi pode ser visualizada usando um microscópio de fluorescência com filtro apropriado para rot domine em uma ampliação de 100x. Como método alternativo para induzir a formação de Brady ZO, pode-se ativar macrófagos derivados da medula óssea infectados com interferon gama e lipopolissacarídeo ou LPS. Para começar, prepare primeiro o meio condicionado L 9 29 para este processo.
L 9 29 é um espelhamento de uma linhagem celular de fibrossarcoma que secreta fator estimulador de colônias de macrófagos após longos períodos de cofluência. Esse meio condicionado pode ser usado para diferenciar células da medula óssea de camundongo em macrófagos em cultura celular. Para preparar o meio condicionado, cultive um frasco de 150 centímetros quadrados de células L 9 2 9 até a cofluência a 37 graus Celsius. Em seguida, incube-as por mais sete a nove dias, até que apresentem aspecto esférico e comecem a se desprender da superfície do frasco.
Colete o meio e quaisquer células destacadas em um tubo de 50 mililitros e centrifugue a 420 ×g por 10 minutos. O sobrenadante resultante é o meio condicionado: um frasco de 150 centímetros quadrados de células L 9 29 produzirá 30 mililitros de meio condicionado, que é o volume necessário para preparar 150 mililitros de meio BMC. Lembre-se de preparar o DMEM para BMC com o L 9 29 cm a ser usado para o desenvolvimento de BMC.
Para visualizar protocolos em vídeo detalhados ilustrando o método de isolamento de células da medula óssea. Para o fêmur de camundongo, visualize os seguintes protocolos em vídeo após as CMO terem sido incubadas por cinco dias. Em placas de Petri bacteriológicas, adicione 10 mililitros de meio para CMO, que conterá meio condicionado de células L 9 2 9, a cada placa e incube por mais dois dias, após os quais as células estarão completamente desenvolvidas.
Macrófagos derivados da medula óssea madura ou BMS podem ser subcultivados por uma a duas semanas após sua maturação. Para dividir os BMS, remova o meio e adicione cinco mililitros de PBS 1X frio incubado a quatro graus Celsius por 30 minutos, até que as células comecem a se desprender. Enxágue as células da placa com uma pipeta de transferência estéril. Recolha os BMS em um tubo cônico de 50 mililitros e pelote as células a 420,5 × g por 10 minutos.
Resuspenda o pellet em 10 mililitros de meio BMC e, em seguida, utilize um hemocitômetro para determinar a densidade celular de semeadura. Duas vezes 10 à quinta BMS por poço. Em uma placa de 24 poços contendo lamínulas redondas no fundo, deixe as células aderirem durante a noite antes de infectar com T. gondii.
Células em excesso podem ser repicadas em placas de Petri para uso posterior. Para ativar as BMS, prepare o meio de ativação realizando uma sonicação do LPS em banho-maria por dois minutos para romper quaisquer agregados. Em seguida, ao meio BMC, adicione 100 nanogramas por mililitro de LPS e 100 unidades por mililitro de IFN gama.
Por fim, remova o meio BMC dos poços e substitua por um dos meios de ativação. Incube a 37 graus Celsius, 5% dióxido de carbono por três dias. As BMCs podem ser coradas conforme previamente demonstrado com fibroblastos de prepúcio.
Nestes exemplos, toxoplasma Gandhi I Bradys são marcados com DBA fluorescente em fibroblastos da pele prepucial humana. Sob estresse de pH. A parede do cisto é marcada fluorescentemente, conforme mostrado nesta seção transversal de um cisto in vitro em dms que foram ativados com IFN gama e L-P-S-D-V-A.
A coloração também está presente, como mostrado aqui na superfície da vacúolo. Acabamos de mostrar como corar *Toxoplasma gondii* in vitro, cistos em fibroblastos e macrófagos ativados. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de planejar para que os parasitas e as células hospedeiras estejam prontos no mesmo dia.
É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este vídeo demonstra técnicas para induzir e visualizar a formação da parede do cisto em Toxoplasma gondii utilizando macrófagos e fibroblastos. O estudo foca-se em como estresses ambientais podem desencadear a formação de cistos, o que é observável por meio de microscopia de imunofluorescência.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Imunologia
- Biologia Celular
Contexto
- Toxoplasma gondii pode formar cistos em resposta a estresses ambientais.
- A formação de cistos pode ser modelada in vitro utilizando técnicas de cultura de tecidos.
- Macrófagos e fibroblastos atuam como células hospedeiras para o parasita.
- Lectinas fluorescentes são utilizadas para visualizar as paredes dos cistos.
Objetivo do Estudo
- Induzir a formação da parede do cisto em Toxoplasma gondii.
- Visualizar os cistos utilizando microscopia de imunofluorescência.
- Compreender as respostas ao estresse do parasita em células hospedeiras.
Métodos Utilizados
- Cultivo de macrófagos derivados da medula óssea e células fibroblásticas.
- Infecção de células hospedeiras com Toxoplasma gondii.
- Indução de respostas ao estresse mediante alteração do pH ou ativação de macrófagos.
- Aplicação de lectinas fluorescentes para visualizar paredes do cisto.
Resultados Principais
- A formação da parede do cisto foi induzida com sucesso in vitro.
- A microscopia fluorescente permitiu a visualização clara dos cistos.
- Tanto a alteração de pH quanto a ativação de macrófagos levaram à formação de cistos.
- As técnicas demonstradas podem ser aplicadas a estudos futuros sobre Toxoplasma gondii.
Conclusões
- O estudo fornece um método confiável para induzir e visualizar cistos.
- Compreender a formação de cistos pode auxiliar no estudo da biologia de Toxoplasma gondii.
- Essas técnicas podem ser úteis para pesquisas futuras sobre interações hospedeiro-parasita.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a desmistificação mecanicista da conversão em bradizoítos de Toxoplasma gondii, uma etapa fundamental para compreender a infecção crônica e o risco de reativação. Ao modelar a formação de cistos induzida por estresse in vitro, os pesquisadores podem avaliar os efeitos de compostos sobre as vias de persistência do parasita. A abordagem apoia a validação de alvos e a triagem fenotípica no estágio inicial de descoberta de intervenções antiparasitárias.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Investigar hipóteses terapêuticas em torno das vias de resposta ao estresse do parasita que regulam a diferenciação de taquizoítos em bradizoítos.
- Valor Operacional: Fornece um sistema reprodutível para validar funcionalmente alvos envolvidos na formação da parede do cisto e na persistência do parasita.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera formas de bradizoítos relevantes para doenças com marcadores quantificáveis da parede do cisto, prontos para ensaios.
- Valor Operacional: Permite a triagem padronizada, baseada em leitura fluorescente, de compostos que inibem ou induzem a formação de cistos sob condições controladas de pH ou ativação imune.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia o desenvolvimento de modelos pré-clínicos ao associar a formação de cistos in vitro a fenótipos de infecção crônica relevantes para a tropismo de tecidos neuropáticos e musculares.
- Valor Operacional: Facilita a avaliação alinhada a biomarcadores da carga de cistos como um indicador translacional da eficácia de fármacos em modelos de persistência.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere nos fluxos de trabalho de descoberta inicial até a identificação de compostos líderes, fornecendo uma plataforma de triagem fenotípica para compostos que visam a conversão de estágios do parasita.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre vias de sinalização de estresse em parasitas e a desriscagem biológica de mecanismos de persistência.
- Triagem: Oferece padronização de ensaios e saídas quantitativas de fluorescência para avaliação confiável de compostos em formatos de 24 poços.
- Análises: Permite a medição da formação da parede do cisto como variável dependente para comparar condições de estresse ou tratamentos com compostos.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao modelar a formação de bradizoítos observada em tecidos do SNC e musculares.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para o estudo da conversão de estágios de parasitas apicomplexados em múltiplos tipos de células hospedeiras.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva no direcionamento de vias de diferenciação do parasita, reduzindo a ambiguidade mecanicista em modelos de infecção crônica.
- Valor Operacional: Padronização da indução e visualização de cistos em sistemas de fibroblastos e macrófagos melhora a reprodutibilidade.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avançar/não avançar ao identificar compostos que modulam a formação de bradizoítos, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados em programas antiparasitários.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos com base nos efeitos na formação da parede do cisto como biomarcador de persistência.
Considerações de Implementação
- É necessária experiência em cultura de parasitas, manutenção de células hospedeiras e microscopia de imunofluorescência.
- É essencial o acesso a microscopia de fluorescência com conjuntos de filtros apropriados para detecção de rodamina.
- A padronização dos protocolos de ativação com IFNγ e LPS garante consistência em experimentos baseados em macrófagos.
- A adaptação a diferentes linhagens celulares hospedeiras requer validação da permeabilidade da parede do cisto e acessibilidade da lectina.
- O controle ambiental dos níveis de CO2 e pH é crítico para indução reprodutível em sistemas de fibroblastos.
