Eletroforese em gel de agarose de amplicons de DNA pós-PCR: um método para analisar produtos de PCR multiplex e avaliar o sucesso da reação de PCR

Para analisar os amplicons de DNA - fragmentos de DNA amplificados de comprimento específico - resultantes da reação em cadeia da polimerase multiplex, PCR, usando eletroforese em gel de agarose, montar uma bandeja de fundição com um pente para criar poços para carregamento de amostras.

Despeje uma concentração adequada de agarose fundida, um polissacarídeo linear, dissolvido em tampão de eletroforese, complementado com um corante de DNA fluorescente, na bandeja de fundição e deixe solidificar.

A agarose derretida polimeriza, formando um gel tridimensional com poros microscópicos.

Coloque o gel fundido em um tanque de eletroforese, com o lado do pente orientado próximo ao cátodo negativo. O tanque contém o tampão de eletroforese usado na preparação do gel para manter a condutividade ideal. Retire o pente.

Transfira a amostra do produto de PCR, misturada com a solução de corante de carregamento para monitorar a migração da amostra, para os poços. Carregue um poço com escadas de DNA de comprimento definido. Inicie a eletroforese.

Os amplicons de DNA, com grupos fosfato negativos uniformemente espaçados, migram dos poços para o gel em direção ao ânodo positivo e se separam com base em seu comprimento devido à alta mobilidade dos amplicons mais curtos do que os maiores. Simultaneamente, o corante de DNA fluorescente positivo no gel migra na direção inversa e se combina com os amplicons de DNA, intercalando entre as bases.

Após a eletroforese, imagem do gel usando luz ultravioleta. Para uma PCR bem-sucedida, os amplicons de DNA intercalados por corante aparecem como bandas fluorescentes discretas mais próximas da escada do comprimento esperado do amplicon. O rendimento do amplicon pode ser estimado através da intensidade de fluorescência.

De acordo com as recomendações do fabricante, adicione pó de gel de agarose em 1x tampão TBE para atingir 1,5 (peso/volume) por cento e aqueça para dissolver.

Antes da fundição, incline a solução de gel dissolvido brevemente em água corrente. Adicione 5 microlitros de corante de ácido nucleico fluorescente por 50 microlitros de solução de gel e misture.

Monte e nivele a bandeja de fundição. Adicione pentes conforme apropriado para o número de amostras. Despeje a solução de gel no gesso e espere que solidifique.

Em seguida, mergulhe o molde contendo o gel em tampão 1x TBE em um sistema de eletroforese em gel. Misture 5 microlitros dos produtos PCR com 2 microlitros de corante de carga em novas tiras de PCR. Transfira 5 microlitros das misturas para os poços no gel. Salve pelo menos um poço vazio. Adicione 5 microlitros de escada de DNA no poço vazio para referência.

Conecte os eletrodos e passe o gel a 110 volts por 15 centímetros por aproximadamente 1 hora. Use um sistema de imagem de gel baseado em UV para verificar a presença de várias bandas que representam amplicons de PCR.