JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 2:24 min • July 8th, 2025
Pegue uma larva de peixe-zebra injetada com esporos de fungos no ventrículo do rombencéfalo.
Os macrófagos são recrutados para o local da injeção, formando um aglomerado apertado ao redor dos esporos.
Os esporos sofrem engolfamento fagocítico por macrófagos.
Esses esporos têm a capacidade de resistir à degradação dentro do fagossomo, permitindo que germinem em hifas e induzam a morte celular necrótica do macrófago.
As hifas possuem padrões moleculares associados a patógenos expostos, ou PAMPs, em sua superfície.
Os neutrófilos recrutados para o local da infecção reconhecem e se ligam aos PAMPs. O contato com neutrófilos desencadeia um fenótipo complexo de hiper-ramificação nas hifas, dificultando assim seu engolfamento pelos neutrófilos e facilitando a evasão imunológica.
Homogeneizar a larva, liberando os esporos e hifas viáveis do fungo. Centrifugue para remover os detritos celulares e coloque o sobrenadante em um meio de crescimento.
Após a incubação, conte as unidades formadoras de colônias fúngicas ou UFCs.
As contagens de UFC representam o número de esporos de fungos viáveis que escaparam das defesas imunológicas do hospedeiro.
Imediatamente após a injeção, transfira oito das larvas para tubos individuais de 1,7 mililitro e eutanasia-as. Prepare 1 mililitro de PBS com ampicilina e canamicina. Remova o máximo de líquido possível dos tubos com as larvas. Em seguida, adicione 90 microlitros de PBS com antibióticos.
Homogeneizar as larvas em um lisador de tecido a 1.800 oscilações por minuto por 6 minutos. Em seguida, gire-os para baixo a 17.000 vezes g por 30 segundos. Pipete a suspensão homogeneizada de cada tubo até o meio de uma placa GMM rotulada e espalhe-a usando um espalhador descartável em forma de L, tomando cuidado para evitar espalhar contra a borda. Incube as placas de cabeça para baixo a 37 graus Celsius por 2 a 3 dias. Em seguida, conte o número de colônias formadas.