水系でのウイルス産生率を予測

この手順の全体的な目標は、水生微生物群集でウイルスが産生される速度を決定することです。これは、まず、天然の微生物群集を維持しながら、目的のサンプル中の遊離ウイルスの量を減らすことによって達成されます。手順の2番目のステップは、コンディションを刺激するサンプルをインキュベートし、2〜3時間ごとに最大10時間サブサンプルを収集することです。

手順の3番目のステップは、各時点から収集されたサブサンプル内のウイルスを列挙することです。手順の最後のステップは、サンプル内でウイルス粒子の存在量が増加した速度を決定し、ウイルス産生速度を決定することです。最終的には、列挙型から微生物群集内でウイルスが産生される速度を示す結果を得ることができ、研究者はウイルス活動による微生物の死亡率を推測することができます。

ねえ皆さん。私の名前はオードリー・マディソンで、テネシー大学のスティーブン・ミルハム博士の研究室と微生物学部で働いています。今日は、チャールズ・バドフとクレア・キャンベルの助けを借りて、ウイルスの生成速度と水生システムを分析する手順を紹介します。

これを行うために、サンプル中の遊離ウイルスの数を減らし、ウイルス感染した微生物の溶解に対してそれらが再発する速度を列挙します。現在、私たちの研究室ではこの手順を使用して、ウイルスの生態とウイルスが微生物群集をどのように形成するかを研究しています。さて、ご紹介したところで、さっそく始めましょう。

この手順を開始する前に、約20リットルの海水をできるだけ無菌的に収集します。サンプルが収集されたら、直径142ミリメートルの0.8ミクロンフィルターで水を事前にろ過します。生物学的に生産的なシステムの場合、より大きな細孔サイズまたはガラス繊維フィルターによるろ過により、これを先取りすることができます。

超ろ過水を得るには、AmCon M 12システムのような限外ろ過システムを設置し、すべてのウイルスを排除するためのらせん状に巻かれたメンブレンカートリッジを使用します。その後、サンプル中のウイルスは除去され、15〜16キロの背圧で最大速度の約25%で濃縮されます。テート美術館には、約500ミリリットルの広さで、現在濃縮されているウイルスコミュニティが含まれており、他の研究のために保存される可能性がありますが、ウイルスを含まない透過液はウイルス産生アッセイに使用されます。

毎日使用した後は、フィルターカートリッジの膜が損傷しないように、Omicron M 12システムを清掃してください。海水を扱う場合は、少なくとも6リットルのMilli Q水でメンブレンを洗い流した後、0.1モルの水酸化ナトリウム溶液で30〜45分間洗浄します。次に、カートリッジをさらに6リットルのMilli Q水ですすいでください。

完成したら、スパイラルカートリッジは摂氏4度の0.05モルリン酸溶液に保存できます。ウイルス還元法を開始するには、ウイルスフリー水と同じ場所から採取した500ミリリットルの海水サンプルを、0.2マイクロノミカルポアサイズの低タンパク質結合フィルターを備えたステレオフィルターユニットに入れます。この時点で、サブサンプルも収集して、開始水中のウイルスとバクテリアの総存在量を決定します。

200ミリメートル水銀未満でサンプルを静かに真空加圧しながら、滅菌トランスファーピペットを使用してサンプルを連続的に蘇生させ、フィルターに細菌細胞が集中するのを抑制し、細菌懸濁液に500ミリリットルのウルトラ濾液を3容量ずつ加えて、細菌集団を一定の密度に保ちながら、サンプル中の遊離ウイルスの量を減らします。最後に、細菌画分をウイルスフリーの超ろ過水で500ミリリットルに希釈します。次に、150ミリリットルの3つの反復に分割し、反復を透明な250ミリリットルのポリカーボネートボトルに入れます。

これは、タイムゼロのサンプルセットを表します。タイムゼロサンプルから細菌およびウイルスの存在量推定のためのサンプルを採取します。サンプルを最終濃度2.0〜2.5%の滅菌グルタルアルデヒドのクライオバイアルに移します。

固定剤として、すぐにフラッシュし、これらのサンプルを液体窒素で凍結し、処理されるまで摂氏マイナス80度で保存します。あるいは、接線流システムを使用して海洋微生物を濃縮することもできます。TFF法を使用するには、約500ミリリットルの天然サンプルを採取します。

ウイルス還元法について説明したように、超ろ過されたウイルスフリー水で細菌画分が約10〜15ミリリットルに減少した場合、0.2ミクロンの公称細孔径タンジェンシャルフローろ過システムを使用してこのサンプルを濃縮し、得られた複製ボトルをインキュベートします。海上の環境チャンバーを使用し、周囲温度を維持する表層水の供給に接続された流動海水インキュベーターを使用します。光レベルは、青色の着色アクリルまたは減光フィルターネットを使用して光強度を下げることにより、表面条件に合わせることができます。

フィールドステーションやラボで作業する場合、または海水が利用できない流れの場合は、照明付き成長インキュベーターを使用できます。時間ゼロでサンプルに対して実行された方法により、少なくとも 10 時間、2.5 時間ごとにサブサンプルを収集し続けます。顕微鏡サンプルに加えて、一部の研究者は特定のウイルスの定量的PCR分析のために水を収集したいと思うでしょう。

QPCRサンプルの場合は、固定剤を含まないクライオバイアルに5ミリリットルのサンプルを加え、ウイルス産生の準備として液体窒素で直ちに急速凍結し、凍結したサンプルを氷上で解凍し、書面によるプロトコルに記載されているように溶液を新たに調製します。次に、25ミリメートルの0.02ミクロンの孔径とディスクフィルターを0.45ミクロンのセルロース系バッキングフィルターの上に置きます。次に、850マイクロリットルの固定サンプルをアナディフィルターの上部に加え、完全に乾くまで20キロパスカル未満で真空にします。

アノディスクフィルターが乾いたら、100マイクロリットルのサイバーグリーンワーキング溶液を滅菌ペトリ皿にピペットで入れます。そして、バキュームをかけたまま、フィルタータワーからアノディスクを慎重に取り外し、サイバーグリーンの上に置きます。サンプルを暗所で室温で20分間インキュベートします。

サイバーグリーン溶液からフィルターを慎重に取り外し、キムワイプでフィルターの背面を吸い上げて、残留染料をすべて取り除きます。次に、顕微鏡スライドにAntifa溶液を少量加え、その上にカバースリップを置きます。カバースリップをはがし、乾燥させたフィルターを顕微鏡スライドに加えます。

再度、カバースリップに少量のAntifa溶液を追加し、ゆっくりとフィルターの上に置きます、広い青色のフィルターで蛍光顕微鏡を使用して列挙ウイルスを形成する可能性のある気泡を確実に除去します各フィルターの少なくとも20の視野を数え、各フィールドグリッドからの総ウイルスを定量化して、フィルター膜全体にウイルスが均一に分布するようにします。3つの独立した複製からウイルスの平均再発率を計算し、生産率からの標準偏差を決定します。最後に、ウイルス還元サンプル中の微生物の開始存在量から希釈存在量までの微生物の希釈率について、これらの速度を修正します。

この研究から得られた主要なデータセットは、インキュベーションからのサブサンプル中のウイルス存在量の再発率です。これらの結果は、各サンプルのウイルス存在量と時間の独立した回帰を形成します。ウイルス様粒子の産生を、落射蛍光顕微鏡を用いて、洞察力による条件で10時間のインキュベーションにわたってモニターしました。

これらのサンプルは、2008年9月にニュージーランド沖で植物プランクトンが大量発生した際に採取されました。ウイルスの生産率を推定する方法を紹介しました。これには、さまざまな限外ろ過システムの使用や、ウイルスの産生速度を測定するための実験の実施が含まれます。

また、これらのウイルスをエピ蛍光顕微鏡で計数する方法も紹介しました。この手順を実行するときは、清潔な機器を使用し、汚れたウイルスを処理し、光を減らし、サンプルを迅速に処理し、使用するたびに限外ろ過カートリッジを適切に洗浄することを覚えておくことが重要です。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。