JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 4:37 min • July 8th, 2025
Trate culturas neuronais com concentrações crescentes de uma toxina de teste.
A toxina entra nas células e é liberada no citosol.
Dependendo de seu potencial, a toxina pode impedir a fusão vesicular, inibindo a liberação de neurotransmissores.
Substitua o meio por um tampão contendo compostos neurofarmacológicos específicos para bloquear os potenciais de ação neuronal.
Coloque a placa de cultura em um estágio de eletrofisiologia. Para iniciar a gravação, conecte um soma de neurônio com uma pipeta contendo um eletrodo de gravação.
Aplique pressão negativa constante para aspirar uma pequena porção da membrana, formando um gigaseal, um selo hermético que garante interferência mínima durante a gravação.
Mantenha uma voltagem de membrana constante para medir as correntes neuronais.
Aplique pulsos de pressão negativa para romper a membrana, estabelecendo contato direto entre o neurônio e a pipeta.
Registre as correntes produzidas no neurônio devido à captação de neurotransmissores, denominadas mEPSCs.
Uma diminuição na frequência de mEPSC com o aumento da exposição à toxina indica a inibição da liberação de neurotransmissores.
Diluir a neurotoxina botulínica sorotipo A até 100 vezes a concentração final desejada no meio de cultura ESN e aquecer a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione um volume apropriado de toxina às culturas DIV 21+ ESN. Gire o prato de cultura e volte para a incubadora.
No momento desejado, aspirar o meio de cultura ESN e lavar duas vezes com tampão de registo extracelular ou ERB. Em seguida, adicione 4 mililitros de ERB suplementado com 5 tetrodotoxinas micromolares para bloquear os potenciais de ação e 10 bicuculinas micromolares para antagonizar a atividade do receptor GABAA. Em seguida, transfira o prato para o equipamento de eletrofisiologia. Não é necessário controle de perfusão nem de temperatura para a inibição medida da transmissão sináptica ou ensaio MIST.
Depois de usar um extrator de micropipeta para puxar pipetas de borossilicato com 5 a 10 megaohms de resistência, preencha uma pipeta com tampão de registro intracelular. Em seguida, mergulhe suavemente a pipeta em reagente siliconizante. Prenda a pipeta de gravação no suporte do eletrodo e conecte uma seringa cheia de ar ao tubo que é portado para o suporte do eletrodo. Forneça pressão positiva constante através da seringa enquanto abaixa a pipeta de registro no ERB.
Depois de pousar suavemente a pipeta de registro no soma do neurônio a ser registrado, tome pressão positiva quebrando o selo da seringa. Reconecte a seringa e aplique pressão negativa sustentada por meio de inspiração suave para formar uma vedação de gigaohm. Assim que a vedação gigaohm for formada, diminua a tensão de retenção para menos 70 milivolts e, em seguida, aplique cuidadosamente pulsos curtos de pressão negativa usando a seringa para entrar na configuração de atacado.
Monitore os picos de capacitância por 30 segundos para confirmar se o patch está estável. Cancele os picos de capacitância no software hacker e mude para o modo de grampo atual para monitorar e registrar o potencial de membrana em repouso. Sem ajuste para potenciais de junção líquida, o potencial de membrana em repouso deve estar entre menos 67 e menos 82 milivolts.
Ajuste o ganho para 2 milivolts por picoamper. Mude para o modo de pinça de tensão e execute um contínuo menos 70 milivolts, gravando por 3 a 5 minutos para detectar correntes pós-sinápticas excitatórias em miniatura.
Analise 3 a 5 minutos de dados registrados para detectar MEPSCs usando as configurações padrão para EPSCs do receptor AMPA em mini-análise. Colete e salve informações sobre eventos detectados. Depois de coletar frequências de mEPSC para 8 a 12 controles e 8 a 12 amostras tratadas com neurotoxina botulínica para cada condição de exposição, analise a frequência em relação à idade e aos controles pareados por lote.