Uma técnica de coloração de órgãos de montagem total para imagens tridimensionais do rim

Pegue um rim de camundongo fixo. Os lipídios no tecido causam dispersão de luz e os pigmentos causam absorção de luz, tornando as células opacas.

Trate o tecido com CUBIC-L para delipidação e descoloração. O álcool amino no CUBIC-L remove lipídios e pigmentos, minimizando a dispersão da luz e aumentando a transparência.

As moléculas de detergente no CUBIC-L também permeabilizam as células.

Introduza um coquetel de anticorpos primários que se liga à tirosina hidroxilase citoplasmática nos neurônios dos nervos simpáticos e à actina do músculo liso alfa nas células musculares lisas dos vasos.

Adicione anticorpos secundários marcados com fluoróforo que se ligam aos anticorpos primários.

Realize a pós-fixação do tecido para preservar o tratamento com anticorpos.

Mergulhe o tecido em CUBIC-R+ que substitui a água e corresponde ao índice de refração das proteínas, minimizando ainda mais a dispersão da luz e aumentando a transparência.

Sob um microscópio de fluorescência de folha de luz, folhas de luz iluminam o tecido, excitando os fluoróforos.

Capture a luz emitida pelo fluoróforo e reconstrua uma imagem tridimensional, exibindo a distribuição nervosa simpática ao redor das artérias do rim.

Para começar, realize a fixação por imersão imediatamente após a fixação da perfusão e amostragem renal, imergindo o rim em paraformaldeído a 4% a 4 graus Celsius por 16 horas. Faça três lavagens usando PBS por duas horas cada. Realize o processo de descoloração e delipidação imergindo o rim fixo em sete mililitros de 50% CUBIC-L em um tubo de fundo redondo de 14 mililitros com agitação suave à temperatura ambiente.

Após seis horas, mergulhe o rim em sete mililitros de CUBIC-L em um tubo de fundo redondo de 14 milímetros com agitação suave a 37 graus Celsius por cinco dias. Atualize o CUBIC-L todos os dias. Quando a descoloração e a delipidação estiverem concluídas, use uma colher dispensadora para o manuseio da amostra e lave o rim três vezes com PBS em temperatura ambiente por duas horas.

Imunocorar o rim delipidado em anticorpos primários diluídos em solução tampão de coloração com agitação suave em um agitador de incubadora a 37 graus Celsius por sete dias. Em seguida, lave o rim com 0,5% de Triton X-100 em PBS, também conhecido como PBST, em temperatura ambiente por um dia. Para coloração de anticorpos secundários, trate o rim com anticorpos secundários no tampão de coloração no escuro com agitação suave a 37 graus Celsius por sete dias. Corrija a coloração com uma lavagem PBST em temperatura ambiente por um dia.

Após a fixação, mergulhe o rim em formaldeído a 1% em PB por três horas e lave-o com PBS em temperatura ambiente por seis horas. Realizar a correspondência do índice de refração imergindo o rim em sete mililitros de 50% CUBIC-R+ em tubo de fundo redondo de 14 mililitros com agitação por um dia, seguido de tratamento com sete mililitros de CUBIC-R+ com agitação em temperatura ambiente por dois dias.