Uma injeção de plasma rico em plaquetas no tendão de Aquiles seccionado de um rato

Coloque um rato receptor anestesiado com um membro posterior raspado em uma almofada quente sob um microscópio de dissecação.

Incisar a pele e dissecar a fáscia, expondo o complexo do tendão de Aquiles.

Remova o tendão plantar e excise um pequeno segmento do tendão de Aquiles, criando uma lesão.

Suture a incisão e permita que o rato se recupere.

Colete sangue total de um rato doador geneticamente diferente, misturado com um anticoagulante.

Centrifugue para obter uma fase inferior de glóbulos vermelhos e uma fase superior de plasma rico em plaquetas, ou PRP.

Transfira o PRP para um tubo e gire as plaquetas. Remova parcialmente o sobrenadante e ressuspenda as plaquetas para obter o PRP concentrado.

Adicione cloreto de cálcio e incube para induzir a ativação plaquetária. Em seguida, injete as plaquetas ativadas no local suturado do receptor.

As plaquetas ativadas liberam citocinas e fatores de crescimento específicos que induzem o reparo do tendão no local da lesão.

Comece pesando e marcando o rato. Depois de confirmar o nível adequado de sedação por pinça do dedo do pé, aplique gotas de água nas córneas do animal e remova os pelos do membro posterior esquerdo. Desinfete a pele exposta com uma diluição de 1 a 10 de solução de isobetadina e coloque o animal em uma almofada de aquecimento a 20 graus Celsius, sob um microscópio de dissecação.

Na posição de débitos laterais com o membro posterior esquerdo na posição superior, segure a pata do membro posterior esquerdo com uma pinça e faça uma incisão lateral de 20 a 25 milímetros na pele ao redor do tendão de Aquiles, usando uma tesoura fina. Disseque a fáscia para expor o complexo do tendão de Aquiles e remova o tendão plantar.

Corte o tendão de Aquiles transversalmente 5 milímetros proximal à sua inserção no calcâneo e remova uma porção de 5 milímetros de comprimento. Em seguida, use fio reabsorvível em suturas contínuas para fechar a fáscia e a pele e coloque o rato sob uma fonte de calor com monitoramento até a recuperação total. Enquanto os animais receptores estão se recuperando, colete 20 mililitros de sangue total de um coração de rato doador, por animal experimental, em tubos individuais contendo citrato de sódio tamponado a 3,2%.

Para obter o plasma rico em plaquetas, centrifugue o sangue e use uma pipeta de transferência de plástico para colher cuidadosamente a fase superior contendo PRP em um segundo tubo de plástico. Determine o volume de PRP coletado e meça a contagem de plaquetas em um analisador hematológico.

Centrifugue novamente o PRP e transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de plástico. O volume restante no tubo PRP deve ser em torno de 2/3 do volume necessário para atingir 2,5 x 10⁶ plaquetas por microlitro. Em seguida, ressuspenda suavemente o pellet de plaquetas com pipetagem. Meça a contagem de plaquetas deste plasma rico em plaquetas concentrado, adicionando de volta o volume apropriado de plasma autólogo pobre em plaquetas para atingir a concentração alvo, conforme necessário.

Ative as plaquetas com 50 microlitros de cloreto de cálcio por mililitro de PRP por cerca de 1 hora em temperatura ambiente. Em seguida, carregue as plaquetas em uma seringa de 1 mililitro equipada com uma agulha de calibre 21 e injete 50 microlitros de plaquetas diretamente no local da sutura de cada animal.