使用完全型KnockOut血清替代无饲养层培养基冻存与复苏人iPS细胞

本实验的总体目标是在饲养层依赖或无饲养层的培养条件下，对诱导多能干细胞（IPS细胞）进行冷冻保存和复苏。首先，按照常规方法开始对IPS细胞进行包装。实验的第二步是将细胞转移至无血清冷冻保存培养基中。

该操作流程的第三步是按照常规方法进行细胞冻存。流程的最后一步是复苏细胞并开始常规培养。最终可获得相关结果，通过冻融后细胞健康的形态学特征和良好的复苏状态，证明在无血清冻存液中成功实现了诱导多能干细胞（IPS细胞）的冷冻与复苏。

大家好，我是 Life Technologies 公司 GCO 站点的 Kate Wagner。本实验方案的可视化演示至关重要，因为诱导性多能干细胞（IPCs）对冻存和温度变化（T 细节）非常敏感。本方案的便利之处在于，您可以在整个操作流程中使用无血清替代物（knockout serum replacement）。

目前，KSR 系列产品包含一系列完整的培养基和试剂，可用于饲养层依赖、无饲养层及无异源成分培养您的胚胎干细胞和诱导性多能干细胞。KSR 可用于细胞系建立、生长、冷冻保存、扩增以及分化的最初步骤。以下视频将向您展示如何使用 KSR 在无菌操作台中进行细胞的冻存与复苏操作。

开始此操作时，首先将适量的完全无饲养层培养基在水浴中预热至37摄氏度，然后从培养容器（本例中为60毫米培养皿）中吸除用过的培养基，并用DPBS冲洗人诱导多能干细胞两次。

然后向培养皿中加入1毫升dispa。将培养皿在37摄氏度下孵育3分钟。随后吸除dispa溶液，并用DPBS轻轻洗涤细胞。

接着，加入完全无饲养层培养基覆盖培养皿，并使用细胞刮轻轻刮取细胞，将细胞转移至无菌的15毫升离心管中。用完全无饲养层培养基冲洗培养皿，轻轻喷洗未脱落的细胞。将冲洗液转移至含有细胞的同一15毫升离心管中。

用培养基再次冲洗培养皿，并将冲洗液与细胞一同在室温下以1000 RPM离心3分钟，使细胞形成沉淀。离心后，小心吸除并弃去上清液，避免扰动细胞沉淀。轻轻弹击离心管管底，使细胞沉淀完全悬浮。

然后使用5 mL血清学移液管加入1 mL冻存液A，通过轻轻吹打使细胞重悬。待细胞团块均匀悬浮后，以滴加方式向离心管中加入1 mL冻存液B，同时轻轻旋转细胞悬液以混匀。将1 mL细胞悬液分装至每个冻存管中，在异丙醇 chamber 中于-80°C过夜冷冻细胞。

次日，将细胞冻存管转移至液氮罐中进行长期保存。将冻存的细胞管放入37摄氏度水浴中，快速解冻约三到四分钟，直至管内仅剩微小冰块。从水浴中取出冻存管后，用70%异丙醇喷洒以消毒，然后使用5毫升移液器将管内全部内容物无菌转移至15毫升锥形管中。

下一步可能是该操作过程中最困难的部分。必须缓慢而小心地将无饲养层培养基加入细胞中。为减少渗透压冲击，需将4毫升完全无饲养层培养基逐滴缓慢加入15毫升锥形管中的细胞内。

加入培养基时，轻轻前后移动离心管以混匀细胞，以减少细胞的渗透压冲击。完全无饲养层培养基可替换为含甲硫氨酸条件培养基的敲除血清替代物培养基，或含敲除血清替代物的饲养层用培养基；具体培养基制备方法请参见实验方案文本。

加入全部四毫升培养基后，在室温下以1000转/分钟离心五分钟。离心后，小心吸除并弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。将细胞沉淀轻轻重悬于四毫升完全型无饲养层培养基中。

使用5 mL移液管，将细胞悬液逐滴轻柔地加入已包被明胶的60 mm培养皿中。将培养皿置于36至38°C、含4%至6%二氧化碳的湿润空气培养箱中。轻轻以南北、东西方向摇晃培养皿，使细胞均匀分布。

解冻后24小时。将培养皿中的培养基更换为新鲜培养基。此后每天更换一次用过的培养基，直至细胞融合度达到约70%至80%。

此对比图像显示了在涂有Gelt TRX的培养皿中，使用完全血清替代物、无饲养层培养基培养的人诱导性多能干细胞。这些诱导性多能干细胞表现出类似于人胚胎干细胞的形态特征，具有较大的细胞核和较少的细胞质。图中展示了细胞解冻后及使用knockout血清替代物的培养示例。

此处显示的是在 gelt TrackX 上的无饲养层培养基。按照本实验步骤操作时，需注意保持所有细胞克隆大小一致。在进行冷冻保存时，这有助于提高细胞复苏效率。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。