רזולוציה גבוהה סיבים אופטיים עבור Microendoscopy באתרו נייד הדמיה

באופן מסורתי, מחקרים ביולוגיים וקליניים הדורשים ניתוח מיקרוסקופי ברזולוציה ברמה התאית בוצעו באמצעות הרצת מספר ניסויים במקביל, כאשר דגימות בודדות הוסרו מהמחקר בנקודות זמן עוקבות להערכה באמצעות מיקרוסקופיה של אור. בעוד שמיקרוסקופיה קונפוקלית, רב-פוטונית ומיקרוסקופיה של הרמוניקה שנייה הן כולן טכניקות שימושיות לדימיון in situ, התשתית הנדרשת היא מורכבת ויקרה, וכוללת מערכות סריקת לייזר ומקור אור מורכב. כאן אנו מדגימים כיצד לבנות מערכת מיקרו-אנדוסקופ סיב אופטי ברזולוציה גבוהה ביום אחד, תוך שימוש ברכיבים זמינים ממדף בעלות של פחות מ-5,000 דולר ארה"ב.

הפלטפורמה מציעה גמישות מבחינת רזולוציית תמונה, שדה ראייה ואורך גל פעולה. ראשית, מורכב שלדה פשוטה של מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי-פלואורסצנטית (epi fluorescence) כדי להכיל מקור אור, מסננים אופטיים, עדשות, צרור סיבים אופטיים ומצלמת CCD. לאחר מכן, מותקנות עדשות הדימוג, היוצרות תמונה מוגדלת של צרור הסיבים האופטיים על מצלמת ה-CCD.

לאחר מכן מותקן מקור LED עם אופטיקת תאורה כדי לספק אור עירור פלואורסצנטי לדגימה. לבסוף, באמצעות המיקרו-אנדוסקופ המורכב, הדמיה בזמן אמת חושפת פרטים ברמה התאית של דגימות מסומנות פלואורסצנטית, כולל תרביות in vitro, מודלים של בעלי חיים in vivo ונבדקים אנושיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו בהשוואה לשיטות קיימות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית או מולטי-פוטונית, הוא שהיא פשוטה וזולה מספיק כדי שחוקרים הפועלים במגוון רחב של תחומים יוכלו ליישם אותה במהירות ולהתאימה לצרכיהם הספציפיים.

המיקרו-אנדוסקופ ברזולוציה גבוהה המתואר כאן צריך להיחשב כתצורת בסיס עם מספר וריאציות אפשריות בהרכבה וביישום. בבחירת רכיבים ליישום ספציפי, יש לקחת בחשבון את הקשרים האינהרנטיים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית בין ריכוז הפלואורופור, תאורת פוטובליצ'ינג, עוצמה, רגישות המצלמה, הגבר (gain) וזמן חשיפה. פלטפורמה זו תוכננה לשימוש עם pro flavin כחומר ניגודיות פלואורסצנטי, אך ניתן להגדירה לעבודה עם צבעים פלואורסצנטיים אחרים.

Pro flavin הוא צבע גרעין בהיר עם שיאי אבסורפציה ופליטה באורכי גל של 445 nanometers ו-515 nanometers בהתאמה. שימוש בחומרי ניגוד אחרים יחייב את המשתמש לבחור מסנני עירור, פליטה ומסננים דיכרואיים באופן מתאים להרכבת מערכת המיקרו-אנדוסקופ. התחילו בחיבור שני מוטות כלוב של six inch לשני מוטות כלוב של 1.5 inch כדי ליצור זוג מוטות באורך 7.5 inch. הברגו את המוטות לצד אחד של יחידת מראת הקיפול, ולאחר מכן התקינו מראה בקוטר של one inch.

שלב הבא, הברגו ארבעה מוטות באורך 0.5 inch אל הפאה הנגדית של יחידת מראת הקיפול. החליקו את קוביית הכלוב (cage cube) על מוטות הכלוב באורך 7.5 inch דרך שני חורי המעבר התחתונים. הברגו את המוטות באורך שני inches אל הפאה הצדית של קוביית הכלוב.

באמצעות מתאם מ-C mount ל-SM one, חברו את המצלמה לפלטת כלוב. הדקו את פלטת הכלוב על מוטות כלוב בקוטר 0.5 inch כך שתהיה בקו אחד עם פני יחידת מראת הקיפול. בחרו עדשת שפופרת (tube lens) בקוטר one inch כדי ליצור דמות של צרור הסיבים האופטיים על המצלמה.

יש לבחור את אורך המוקד של העדשה כך שחתך של צרור הסיבים האופטיים יידגם על ידי לפחות שני פיקסלים. בעת ההדמיה למצלמה, הכניסו את העדשה לתוך צינור עדשה באורך של שלושה אינץ' ואבטחו את העדשה באמצעות טבעת קיבוע. מפתח ברגים ייעודי (spanner wrench) מסייע בהברגת טבעות קיבוע לתוך צינורי עדשות ארוכים.

הנח את מסנן הפליטה לתוך שפופרת העדשה בעלת שלושת האינצ'ים, מעל טבעת האבטחה הראשונה, והוסף טבעת נוספת כדי לקבע את המסנן במקומו. ודא כי כיוון המסנן תואם להנחיות של יצרן המסנן. הברג את שפופרת העדשה לצד של קוביית הכלוב (cage cube) הקרוב ביותר למצלמת ה-CCD.

מיקום זה מוצג כאן גם כן. שימו לב שבדיאגרמה, עדשה ומסנן אלו מוצגים ללא שפופרת עדשה של שלושה אינץ'. למען הבהירות, חברו את המצלמה למחשב וצפו בתמונה על המסך.

כוון את מכלול הכלוב לעבר אובייקט מרוחק והזז את קוביית הכלוב לאורך המסילות עד שדמותו של האובייקט תופיע במיקוד. השתמש במברג כדי להדק את ארבעת הברגים הממוקמים בצדי קוביית הכלוב. ברגים אלו אוחזים במסילות כאשר הם מהודקים ומקבעים את הקובייה במקומה.

פעולה זו תבטיח שעדשות הצינור (tube lenss) יגבישו תמונה ממוקדת של צרור הסיבים על המצלמה כאשר הן משולבות עם עדשת היעד המתוקנת לאינסוף. לאחר מכן, הכניסו את מראת הדיכרואיקה (diic mirror) אל המחזיק ומקמו אותה בזווית של 45 מעלות בתוך קוביית הכלוב (cage cube). הבריגו את עדשת היעד אל פני קוביית הכלוב, בצד המopposite למחזיק עדשות הצינור, באמצעות מתאם הברגה מ-RMS ל-SM1 ושפופרת עדשה מתכווננת.

לאחר מכן, הברגו מחבר SMA לתוך לוחית כלוב והתקינו אותה על המוטות במרחק העבודה של עדשת העדשה. הוסיפו את לוחית הבסיס ואת מכסה הקצה לצדדים הפתוחים של קוביית הכלוב. לאחר מכן, התקינו נורת LED על לוחית כלוב והחליקו אותה אל קצה המוטות בעלי שני האינצ'ים.

הוסף עדשה לשפופרת עדשות בקוטר 0.5 inch כך שכאשר שפופרת זו תהיה מוברגת לצדו של קוביית הכלוב (cage cube), היא תבנה דמות של ה-LED הממלאת את המפתח האחורי של עדשת העצם. כמו כן, הוסף את מסנן העירור לשפופרת העדשות. בשלב זה, ניתן להשתמש בדרייבר LED כדי לשלוט בעוצמת אור ההארה באמצעות אפוקסי.

חברו מחבר SMA עבור סיב בעובי 1030 micron לצורר הסיבים האופטיים בעל שדה ראייה של 720 micron. לפרטים על חיבור סיבים אופטיים, עיינו ב-T Thor labs, מספר קטלוג FN nine six. מדריך לחיבור וליטוש של סיבים אופטיים.

הבריגו את צרור עיני מחבר ה-SMA אל תוך שקע ה-SMA המותקן על מוטות הכלוב. כוון את הקצה הדיסטלי של הצרור לעבר מקור אור רחב-פס; תאור פלורסצנטי יספיק. לאחר מכן, צפו בתמונה של הפנים הפרוקסימלי של הצרור במצלמת ה-CCD. לבסוף, כווננו את מיקום עדשת העדשה על ידי הברגה פנימה או החוצה מקוביית הכלוב.

עד אשר תמונת צרור הסיבים תופיע בפוקוס, הגורם הבודד צריך להיות גלוי בבירור. ניתן להגביר את הרזולוציה המרחבית של המיקרו-אנדוסקופ על ידי הצמדת מיקרו-עדשה או מכלול עדשות לקצה הדיסטלי של צרור הסיבים. אופטיקות אלו מוגדרות כך שבמקום להניח את קצה הצרור ישירות על הרקמה, הקצה מודם על פני שטח הרקמה עם הגדלה.

בכך גדלה תדירות הדגימה המרחבית המוטלת על ידי הניתובי האור של צרור הסיבים. מידת ההגדלה של עדשת ה-grin תואמת לעלייה ברזולוציה המרחבית ובמקביל לירידה פרופורציונלית בשטח הראייה. בחרו עדשת grin עם ההגדלה ומרחק העבודה הרצויים עבור היישום שלכם.

וודאו שקוטר העדשה תואם לקוטר צרור הסיבים שבו אתם מתכננים לעבוד. התקינו את צרור הסיבים ואת עדשת ה-grin על במות מיקום ידניות נפרדות בעלות שלושה צירים תחת מיקרוסקופ בהגדלה נמוכה או סטריאוסקופ לצורך כיול מדויק.

בשלב הבא, הניחו טיפה של דבק אופטי על העדשה או על פני הצמה. בעזרת הממקמים הידניים, הביאו את שני הרכיבים למגע. חשפו את הממשק לאור UV במינון המומלץ על ידי היצרן כדי להקשיח את הדבק.

כדי להגן על עדשת ה-GRIN ועל הממשק המודבק, השתמשו בחתיכה קצרה של צינור נימי מאלומיניום כדי לעטוף את החיבור. החליקו את הצינור מעל החיבור ואבטחו אותו במקומו באמצעות טיפה של אפוקסי בכל קצה של הצינור, והשתמשו בצינור בידוד מתכווץ בחום כדי להשלים את ההרכבה. לפני ביצוע ההדמיה המיקרו-אנדוסקופית, גרמו את חומר הניגוד לתאים או לרקמות המיועדים להדמיה כדי לדגום תאים ותרביות.

ראשית, הסירו את מצע הגידול באמצעות פיפט. לאחר מכן, הוסיפו תמיסת pro flavin על ידי פיפוט עדין אל תוך הבאר. לאחר דגירה קצרה של עד דקה אחת, הסירו את תמיסת ה-pro flavin באמצעות פיפט והשליכו אותה.

שטפו את התאים על ידי הוספה והסרה של תמיסת PBS טרייה לבאר. קיבעו את הקצה הדיסטלי של צרור הסיבים במתקן מאובטח עם במות מיקום ידניות בצירים x, Y, Z ליציבות. במהלך ההדמיה, לאחר יישום הצבע לתאים או לרקמה, הניחו את צרור הסיבים האופטי במגע קל עם הדגימה. צפו בתמונה של צרור הסיבים האופטי על מסך המחשב, באמצעות התוכנה שסופקה על ידי יצרן המצלמה או כל תוכנה מותאמת אישית שתבחרו לפתח.

כווננו את זמן החשיפה והגדרות הגביר (gain) של המצלמה כדי לקבל תמונה בעוצמת בהירות מקובלת. כאשר הוא מורכב כראוי, המיקרו-אנדוסקופ יפעל כמיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי (epi fluorescence microscope) המועבר דרך צרור סיבים אופטיים קוהרנטי. לקבלת תוצאות דימוי אופטימליות, יש להקפיד לוודא ששלושה תנאים מרכזיים מתממשים.

ראשית, יש לדמות את הפנים הפרוקסימלית של צרור הסיבים על גבי מצלמת ה-CCD ללא טשטוש מיקוד (defocus), וזאת כדי להשיג את הרזולוציה המלאה של המערכת. כאן, חלק מצרור סיבים מדומם במיקוד לקוי, במיקוד חלקי ובמיקוד טוב. המיקוד האופטימי נמצא על ידי כיוונון המיקום הממשי של עדשת העצמה ביחס לפני הצרור.

שנית, יש להאיר באופן אחיד את הפאה הפרוקסימלית של צרור הסיבים לאורך כל קוטרו. כפי שתואר קודם לכן, הדבר מושג על ידי הגדרת אופטיקת התאורה לתאורת cola. התמונה המוצגת כאן נרכשה כאשר מדגם פלואורסצנטי אחיד מואר בתצורה מועדפת זו.

התוצאה המקבילה תחת תאורה קריטית מוצגת כאן. מבנה ה-LED מודגש על פני השטח של צרור הסיבים, מה שגורם להופעת תבנית לא רצויה זו המוטלת על מבנה הדגימה האמיתי. שלישית, חשוב לוודא ששני הפנים, הפרוקסימלי והדיסטלי, של צרור הסיבים נקיים וללא שריטות או שבבים.

בדוגמה זו, שאריות תמונה נצמדות לפני הצמה, ונזק בצורת שבב קטן בשעה חמש נראה להיקף הסיב. ניתן להסיר שאריות מפני הצמה על ידי ניקוי באופן דומה למחברים סיב אופטיים קונבנציונליים באמצעות נייר לעדשות ואיזופרופנול או כלי ניקוי סטנדרטיים לסיבים אופטיים. 1483 תאים סומנו ב-pro flavin וצמת הסיבים החשופה הונחה בעדינות על הדגימה.

כאן מוצג דימוי in vitro כאשר עדשת grin בפי 2.5 חוברה לקצה הצרור, ובכך הושג שיפור ברזולוציה המרחבית והפחתה בשטח השדה. דימוי in vivo, שבו צרור סיבים בעובי חיצוני של 0.5 millimeter הועבר דרך מחט gauge 21 והוכנס לרקמת רפידות השומן של בלוטת החלב בעכבר, בוצע כפי שניתן לראות בסרטון זה; אדיפוציטים נראים בבירור עם תנועה הנובעת מהמחזור הקרדיאלי. בדוגמה זו, בוצע דימוי של הרירית הפה במתנדב אנושי בריא באמצעות צרור סיבים גדול יותר בעובי חיצוני של 1.5 millimeter.

בכל הדוגמאות, נעשה שימוש ב-pro flavin כחומר ניגוד פלואורסצנטי לסימון גרעיני. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו ניתן לתכנן ולהרכיב מיקרו-אנדוסקופ סיב אופטי עבור דימוי פלואורסצנטי של תאים ורקמות ב-in C two.