Leukotriene B의 실시간 영상 ₄ 중재 셀 마이 그 레이션 및 β - arrestin로 BLT1 상호 작용

류코트리엔 B 4는 다양한 염증성 세포에서 G-단백질 결합 수용체, BT 1 및 BT 2를 통해 작용을 매개하는 전염증성 분자입니다. LTB four B LT one 경로는 천식, 관절염 및 죽상동맥경화증을 포함한 여러 염증성 질환에서 중요한 것으로 나타났습니다. G-단백질 결합 수용체 또는 GPCR은 화학주성, 세포 내 칼슘 방출 및 유전자 조절과 같은 세포 내 반응을 일으키는 세포 외 신호의 전달을 매개합니다.

세포외 리간드 결합은 이질삼합체 G 단백질의 활성화로 이어지는 일련의 확인 변화를 유도합니다. 그런 다음 G 단백질은 고리형 아데노신 일인산염, 아세톨 트리포스페이트 및 DYL 글리세롤과 같은 두 번째 메신저의 수준을 조절하여 실시간으로 골수 유래 수지상 세포 또는 B MDC에서 류코트리엔 B 4 매개 세포 이동을 모니터링하며 LIKEN은 마이크로 파이펫에서 제어된 흐름을 통해 전달됩니다. 마이그레이션을 평가하기 위해 타임랩스 이미징이 수행됩니다.

본 연구실에서는 이러한 생세포 실시간 이미징 기술을 사용하여 백혈구 트렌드 B 4 수용체 BT 1이 수지상 세포에서 기능적으로 발현된다는 것을 발견했습니다. 우리는 또한 인산화와 베타 정지, 그리고 BT one의 내재화에 대한 의존적 기전을 확인했다. 이러한 기술을 다수 개발한 본 연구실의 Jla 박사와 조교수는 35mm 유리 바닥 접시에 FPS 재조합 G-M-C-S-F 및 재조합 FLT 3를 포함하는 RPMI 1640 배양 배지에 0.5 백만 개의 세포를 준비하여 세포 이동 분석을 위해 골수 유래 수지상 세포 또는 B MDC를 준비하기 위해 살아있는 세포의 이동과 수용체 내재화를 모두 시연할 것입니다.

도금이 완료되면 섭씨 37도에서 16시간 동안 세포를 배양하고 16시간 후에 5% 이산화탄소를 배양합니다. PBS 3ml를 첨가한 다음 흡입합니다. 마지막 흡인 후 이 세척을 최소 두 번 더 반복하고 플레이트에 PBS 2ml를 추가합니다.

세포는 이제 실험을 할 준비가 되었으며 섭씨 37도로 유지해야 합니다. 그때까지 이 비디오의 실험에 사용된 이미징 시스템은 가열 스테이지와 cool SNAP hq가 장착된 Nikon eclipse TE 300 도립 현미경에 부착된 A-T-E-F-M epi 형광 시스템으로 구성됩니다. 디지털 흑백 CCD 카메라.

여기 및 방출 파장은 필터 휠과 Lambda 10 dash two filter wheel 컨트롤러로 제어됩니다. 하드웨어 제어 및 획득 이미지는 metamorph 소프트웨어에 의해 제어됩니다. 두 개의 마이크로 매니퓰레이터가 현미경 스테이지에 부착되어 피펫을 고정하며, 피펫은 함께 제공되는 텍스트의 지침에 따라 제작하거나 구입할 수 있습니다.

전염증성 리간드 류코트리엔 B 4 또는 LTB 4의 100나노몰 스톡 1.5ml를 1.5ml 퍼지 튜브로 옮깁니다. 마이크로 피펫 팁을 용액에 넣고 용액이 이 로딩 방법에 들어가도록 하여 마이크로 피펫을 다시 채우면 마이크로 피펫 끝에 기포가 형성되는 것을 방지할 수 있습니다. 다음으로 마이크로필 바늘에 부착된 1입방센티미터 투베르쿨린 주사기에 1ml의 LTB 4를 넣습니다.

그런 다음 이를 사용하여 상단에서 마이크로 피펫을 천천히 채우고 튜브를 LTB 4개로 채워진 마이크로 피펫에 부착합니다. 그런 다음 마이크로 피펫과 튜브를 리간드로 채워진 1밀리리터 주사기에 부착된 21게이지 1.5인치 바늘에 연결합니다. 이제 리간드로 채워진 마이크로 피펫을 현미경 스테이지의 마이크로 매니퓰레이터 중 하나에 조심스럽게 고정하여 골수 유래 수지상 세포의 라이브 셀 이미징을 수행합니다.

LTB 4 리간드의 적용에 대응하여 인큐베이터에서 도금된 미성숙 b MDC를 제거하고 현미경의 가열된 스테이지에 놓습니다. 60 x 오일 이멀젼 렌즈를 사용하여 세포를 시야에 가져옵니다. 세포가 과도하게 밀집되어 있지 않아 이동을 적절하게 모니터링할 수 있는 영역을 찾습니다.

플루오로 접시에서 뚜껑을 제거합니다. 그런 다음 거친 수동 매니퓰레이터를 사용하여 리간드가 로드된 피펫을 조심스럽게 내리고 가져옵니다. hydraulic fine micro manipulator를 사용하여 세포에 근접합니다.

파이펫에 초점을 맞춥니다. 주사기에서 소량의 압력을 가하여 팁 리간드에서 LTB 4 리간드의 느린 방출을 시작하십시오 리간드는 확산에 의해 매체로 천천히 퍼져야 합니다. 다음으로, metamorph 소프트웨어를 사용하여 이미지 획득 매개변수를 설정하여 2시간 동안 15초마다 명시야 이미지를 획득합니다.

리간드로의 이동 진행을 5분마다 계속 모니터링하십시오. 이 프로토콜에 설명된 방법은 류코트리엔 B 4로의 수지상 세포 이동을 결정하는 데 사용되었습니다. 여기서, 마우스의 골수는 100을 향한 수지상 세포 이동을 유도하였다.

Nan Animal 또는 LTB four가 보이는 이 타임랩스 이미징 비디오는 B MDC가 LTB로 살아있는 세포로 이동하는 것을 보여줍니다. 다양한 화학 유인 물질에 대한 많은 세포 유형의 화학주성 반응을 결정하기 위해 4가지 유사한 방법을 적용할 수 있습니다. 형광 단백질 태그 분자와 결합된 이러한 유형의 이미징은 살아있는 세포에서 분자의 움직임과 상호 작용을 실시간으로 추적하는 데 사용할 수 있습니다.

여기에서는 형광 태그 류코트리엔 B 4 수용체 1과 베타 어레스틴의 상호 작용을 실시간으로 보여줍니다. RBL 2 H 3는 Wister rats에서 분리 된 rat basophilic leukemia cell line이며, 이는 A TCC에서 얻을 수 있습니다. 이 세포는 많은 케모카인 수용체를 발현하지 않지만 케모카인 의존성 신호 경로를 매개하는 세포 구성 요소를 가지고 있습니다.

리간드 유도 BT의 내재화를 평가하기 위해 실시간으로 RBL 2개, H 3개의 세포를 BT 1개의 RFP 및 GFP에서 베타 정지로 transfection합니다. 타임 랩스 이미징 중에 리간드가 플레이트에 추가됩니다. 이러한 단백질의 국소화 변화는 이미지 분석을 통해 평가할 수 있습니다.

G PCR R 내재화를 실시간으로 연구하기 위해 함께 제공된 텍스트의 지침에 따라 B LT, RRP 1개 및 베타 arrest 및 GFP를 RBL 2개의 H 3개 세포로 transfection합니다. 그런 다음 300마이크로리터의 전기천공된 세포와 규칙적인 성장 배지 혼합물을 2밀리리터의 규칙적인 성장 배지를 포함하는 35mm 플루오로 접시로 옮깁니다. 섭씨 37도의 공기를 95%, 이산화탄소를 5%로 하는 가습 분위기에 전지를 놓아 접시 바닥에 달라붙을 수 있도록 합니다.

1시간 후, transfection 배지를 일반 성장 배지로 교체하고 세포를 추가로 18-24시간 동안 incubator에 다시 넣습니다. 배양 후 10밀리몰 히피를 함유한 따뜻한 페닐 레드 프리 RPMI 2ml를 플레이트에 직접 첨가하고 배지를 흡인하여 세포를 두세 번 세척합니다. 그런 다음 1.8밀리리터를 더 추가합니다.

다음으로, 가열된 현미경 스테이지에 배양 접시를 놓습니다. 600 x 오일 이멀젼 렌즈를 사용하여 600x 배율로 이미지를 수집합니다. 그런 다음 적절한 형광 필터로 전환합니다.

세포 표면에서 HBL BT one RFP를 발현하는 건강한 세포를 선택하고 여기에서 이미지를 캡처합니다. RFP 필터 스위치를 GFP 필터로 사용하여 베타 arrest 및 GFP가 세포질에서 발현되는지 확인하고 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 병합된 유사 색상 이미지를 검사하여 미스트의 결과로 발생할 수 있는 형광을 통한 출혈을 확인합니다.

수용체의 표적화는 RFP와 GFP 사이에서 발생하지 않습니다. 다음으로 여기에 타임랩스 이미징을 위한 매개변수를 입력합니다. 16비트 이미지는 카메라 벤딩을 하나씩 설정하여 획득합니다.

적색 및 녹색 형광 이미지는 R-F-P-G-F-P 빔 스플래터를 통해 RFP 및 GFP 형광 필터를 사용하여 순차적으로 캡처됩니다. 소프트웨어가 1시간 동안 32번째 시간 간격으로 이미지를 캡처하도록 지시합니다. 유사한 다이내믹 레인지를 얻을 수 있도록 카메라 노출 시간을 설정합니다.

RFP 및 GFP의 형광 강도용. 1분 동안 이미지를 수집한 다음 t에서 0이 됩니다. 200마이크로리터의 리간드를 방해하지 않고 플레이트에 직접 추가합니다.

60분 동안 형광 이미지를 계속 수집합니다. 리간드를 추가한 후 이미지가 획득되면 순차적 파일 이름을 가진 TIFF 이미지로 자동 저장됩니다. 그런 다음 소프트웨어를 사용하여 파일을 개별 또는 결합 된 이미지로 볼 수 있습니다.

마지막으로, 모든 세포 이미지를 획득한 후 동일한 설정을 사용하여 세포가 없는 일반 미디어로 이미지를 획득합니다. 이미지를 분석하기 위해 배경 이미지로 사용할 파일을 저장합니다. metamorph에서 이미지 빼기 기능을 사용하여 위에서 얻은 실제 데이터 이미지에서 배경을 뺍니다.

이것은 배지의 모든 배경 또는 자가형광을 설명합니다. 그런 다음 파일 메뉴에서 최종 생성된 스택 파일 옵션을 열고 개별 이미지 스택을 엽니다. 다음으로, 영역 측정에서 이클립스 영역 추적 영역을 선택하고 관심 영역을 그리고, 표면 및 세포질 영역을 선택하여 BLT 1 및 베타 어레스틴 전좌에 해당하는 RFP 및 GFP의 형광 강도를 측정합니다.

Excel에 자동으로 연결되는 로그 데이터 옵션을 사용하면 형광 강도의 양을 시간 함수로 추출할 수 있습니다. 이 그래프는 주어진 분자의 전위 역학에 대한 정보를 제공합니다. 이미지 분석에서 G, PCR R 및 세포질 단백질 및 핵의 국소화를 밝힐 수 있습니다.

여기서, RBL 2 H 3 셀의 표면에 BT 1 RFP의 발현이 보입니다. 이 이미지는 동일한 세포의 세포질에서 베타 휴식과 GFP 국소화를 보여주며, 여기서 p 핵 CFP는 핵에서 볼 수 있습니다. 여기에 표시된 색상 결합 이미지는 표면 GPCR과 세포질 단백질의 각 형광 색소 리간드 유도 상호 작용의 뚜렷한 세포 국소화를 나타냅니다.

리간드는 BLT one 수용체와 베타 어레스틴의 전좌를 유도했습니다. 이 비디오는 B LT one RFP 및 베타 어레스트 GFP를 발현하는 세포의 실시간 이미징을 보여줍니다. 1개의 마이크로몰 LTB 4를 추가하면 metamorph 소프트웨어를 사용하여 전좌 패턴의 정량화를 모니터링할 수 있습니다.

대표 세포의 형광 강도에 대한 라인 스캔은 T가 0과 같을 때 표시됩니다. BT one RFP는 멤브레인에서 볼 수 있으며 GFP의 베타 정지는 세포질에서 볼 수 있습니다. RFP와 GFP 라인의 리간드 중첩이 추가되면 수용체와 베타 어레스틴의 공동 국소화가 관찰됩니다.

또한 단백질 이동의 동역학을 여기에서 측정할 수 있습니다. 수용체 내재화와 베타 arrestin 전좌의 동역학. 1개의 마이크로몰 LTB를 첨가한 후 4개를 검사했습니다.

형광 강도는 세포막 및 세포질 위치에서 시간의 함수로 측정되었으며, B LT에 LTB 4개의 리간드, 1개의 RFP 및 베타 어레스트를 추가하고, 1개의 GFP에 트랜스펙션된 RRB 2개의 H, 3개의 세포가 베타 어레스트레스트의 전좌로 이어지며, 1분 이내에 노란색 고리의 형성으로 관찰할 수 있는 세포질에서 막으로의 1개의 GFP를 관찰할 수 있습니다. 하나의 GFP에서 베타 어레스트와 상호 작용하면 BT one RFP는 하나의 GFP 복합체에서 수용체 베타 어레스를 형성하고 5분 이내에 노란색 반점의 출현에서 명백한 바와 같이 엔도솜 형태로 세포질을 통해 전위합니다. 이러한 방법을 사용하여 리간드 의존성 수용체 활성화 상태 및 수용체 활성화와 관련된 중요한 모티프 또는 프로세스를 결정할 수 있습니다.

실험에서 가장 중요한 것은 플레이트가 작동하는 동안 플레이트의 버퍼를 주시하는 것입니다. 실험은 개발 후 1시간이 넘게 진행됩니다. 이 기술은 다양한 포유류 세포 유형에서 오카트 이동 및 수용체 리간드 상호 작용을 탐구하기 위해 케모카인 및 수용체 분야의 연구자들에 등장했습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 케모카인 및 케모카인 수용체와 베타 억제제와 같은 세포질 단백질과의 상호 작용과 관련된 실시간 이미징 실험을 설정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.