一个孤立的视网膜制备，记录从基因标记的视网膜神经节细胞的光反应

该程序的总体目标是记录分离的小鼠视网膜中遗传标记的神经节细胞的光诱发电反应。这是通过首先从小鼠眼中解剖视网膜来实现的。该程序的第二步是用酶处理视网膜以去除剩余的玻璃体。

该程序的第三步是将视网膜神经节细胞面朝上安装在记录室中，将腔室安装在显微镜载物台上，并识别基因标记的神经节细胞。该程序的最后一步是获得已识别的神经节细胞的全细胞记录并记录光诱发电应。最终，可以获得显示特定神经节细胞的功能特性、小鼠视网膜类型并定义它通过单细胞膜片钳记录传达给大脑的信号的结果。

大家好，我叫 Tiffany Schmidt，是明尼苏达大学 Paulo Ka Fuji 博士实验室的神经科学研究生。该技术允许识别和记录确定的、遗传标记的神经节细胞群，以及随后的形态学分析。该技术可以帮助回答视野中的关键问题，例如不同的神经节细胞亚型如何处理视觉刺激的关键特征 在进行手术之前。

要去除视网膜，第一个任务是混合实验所需的八种解决方案。本实验中使用的所有溶液的成分在随附的文本中给出。将 200 毫升细胞外溶液转移到 250 毫升烧杯中，用于视网膜储存。

将剩余的细胞外溶液放入分液漏斗中，以便在记录过程中进行重力富集。这两种溶液都应始终用 95% 的氧气、5% 的二氧化碳保持饱和。为了在实验过程中观察树突，请在细胞内溶液中加入荧光示踪剂，例如 LOR 5 94。

如果您打算在全细胞记录后进行免疫组化，请在细胞内溶液中加入 0.3% 神经生物素。准备好必要的溶液后，通过二氧化碳窒息对小鼠实施安乐死，通过在眼睛后面轻轻插入一个有角度的 2 号镊子并提起眼球来使眼球成核。使用眼科剪刀清洁眼外肌并切断视神经。

将眼球放入装满细胞外溶液的 35 毫米培养皿中。用眼科剪刀剪掉角膜，然后用 5 号镊子拉出晶状体。用 5 号镊子撕开巩膜，切断视网膜和巩膜交界处剩余的视神经。

通过在视网膜和巩膜之间的空间中运行镊子，轻轻地将视网膜从眼罩上拉开。为了节省时间，在两个视网膜上执行每个步骤在进行下一步之前，一个关键步骤是去除附着在视网膜上的玻璃体。首先使用镊子抓住视网膜上方的透明玻璃体。

如果玻璃体成功取出，您会在镊子尖端看到一个小而透明的凝胶状物质。将每个视网膜切成两半，以最大限度地增加可用组织的数量，并更容易将视网膜安装在记录室中。在室温下将视网膜置于含氧细胞外溶液中，并通过只允许最少的环境光（例如来自计算机屏幕的光）来最大限度地减少光照，视网膜可以保持活力约六个小时。

解剖后，从额外视网膜冒泡的溶液中取出 500 微升细胞外溶液。稀释到它里面。胶原酶透明质酸酶溶液的等分试样。

将酶溶液放入 35 毫米培养皿中，然后将其中一个解剖的视网膜转移到 Petri 中。始终轻轻旋转培养皿 15 分钟，在溶液中混合 95% 氧气、5% 二氧化碳。酶溶液去除任何残留的玻璃体，并允许更容易进入神经节细胞层 对于玻璃体较少的年轻动物的视网膜，或者如果观察到不良反应，消化可以缩短到五分钟。

使用吸头被切断的塑料移液管。从含有酶的培养基中取出视网膜。在细胞外溶液中广泛清洗视网膜。

将视网膜转移到记录室中。感光层朝下，用移液管或组织吸走任何残留的液体，然后展开视网膜的侧面以使组织变平。注意只触摸视网膜的边缘，而不是神经节细胞层。

要固定视网膜，请在视网膜上放置一个带有尼龙网的铂环，然后立即用细胞外溶液填充腔室。将记录室安装到显微镜载物台上，然后连接用于细胞外溶液重力灌注的管子、真空抽吸管和接地线。调整重力，使其以每分钟 1 毫升或更快的速度滴落。

如果灌注速度太慢，组织将无法获得足够的氧合，突触信号可能会中断。下一步是设置电极以进行全细胞贴片记录。选择电阻在 3 到 5 兆欧姆范围内的移液器。

用解冻的细胞内溶液等分试样填充记录移液器，然后在 10 x 物镜下使用红外照明和微分干涉对比或 DIC 光学元件将其插入移液器支架中。可视化视网膜和记录移液器。红外光用于最大限度地减少视网膜对可见光的暴露，并最大限度地减少光线适应，切换到 40 倍物镜并将电极置于组织上方的视野中。

本研究中使用的小鼠系在其神经节细胞中表达 EGFP，因此神经节细胞在 Epi 荧光下可见。显微镜使用 480 纳米的落射荧光照亮视网膜。如果视网膜健康，则应该可以看到单个神经节细胞。

不健康的视网膜会有大的颗粒状细胞核，应该丢弃。选择一个荧光神经节细胞进行记录，并使用实验室胶带在计算机显示器上标记所选细胞。切换到红外光学元件，以便可以看到选定的神经节细胞体。

将记录电极放置在目标神经节细胞附近。通过对记录施加轻微的正压来清洁立即覆盖细胞的区域。电极压力通过连接到移液器支架的 12 cc 塑料注射器施加，该注射器在放大器零上带有聚乙烯管。

任何电压偏移。将电极放在选定的神经节细胞上，直到细胞表面出现酒窝。当放大器处于电压钳模式时，施加测试脉冲并监测通过移液器的电流。

施加负压以在电极和电池之间形成密封。当密封开始形成时释放负压，并等待保持电流表明细胞膜和移液器之间存在千兆电气密封。施加柔和的负压脉冲，直到出现电容瞬变，表明已获得全细胞记录模式，然后释放任何压力施加。

如果访问电阻大于 30 兆欧姆，这通常可以通过额外的非常温和的负压脉冲来改善。获得全细胞模式后，关闭红外灯并用黑布盖住显微镜。让细胞暗适应 5 分钟。

五分钟后，准备工作就可以进行录制了。在电流钳模式下，开启全场白光刺激，记录神经节细胞的反应。如果要多次刺激神经节细胞，则应允许视网膜在两次刺激之间根据需要进行暗适应。

此时也可以修改光刺激以包括图案或色度刺激，以便评估神经节细胞的反应特性记录后，细胞内溶液中的荧光示踪剂将通过在落射荧光和 DIC 红外光学之间切换扩散到树突。示踪剂可以在 594 纳米的落射荧光下看到，您可以检查树突以确定神经节细胞是开启关闭还是分层。添加到细胞内溶液中的神经生物素已扩散到神经节细胞中，因此下一步是准备视网膜进行免疫组化。

轻轻缩回移液器，以尽量减少对细胞膜的破坏。请注意，如果您每次制备仅记录和填充一个视网膜神经节细胞，则可以在记录的神经节细胞与其详细形态之间建立特定关联。接下来，将视网膜置于 Paraform 醛溶液中，固定过夜后在 4 摄氏度下固定过夜。

在 PBS 中冲洗固定的视网膜，在两个或更长时间内至少更换 PBS 溶液 6 次。冲洗后，将视网膜转移到含有封闭溶液的板中，将板放在摇床上，静置 2 小时。在室温下，用链球菌证据溶液替换封闭溶液，然后将视网膜放回摇床上，让它在 4 摄氏度下孵育两天。

两天后，用 PBS 冲洗视网膜，进行 6 次冲洗，每次 20 分钟，以固定视网膜。使用矢量盾将其神经节细胞面朝上放在载玻片上。用玻璃盖盖封固介质，用指甲油滑和密封，现在可以在共聚焦显微镜下观察标记的神经节细胞。

该图显示了在 epi 荧光照明下以 40 倍放大倍率观察左侧和 DIC 照明下右侧可见的 GFP 阳性视网膜神经节细胞。如果视网膜健康且解剖成功，则在 DIC 下以高倍率可以看到单个神经节细胞。不健康的视网膜会有大的颗粒状细胞核，应该丢弃。

该图显示了 M 2 在对固有光敏视网膜神经节细胞进行分层时典型的光响应类型。根据给定制剂中基因标记的视网膜神经节细胞的类型，反应特性会有所不同。如果给定神经节细胞的突触反应是完整的，那么该细胞应该在光开始时或以动作电位偏移时做出反应。

在固有光敏性神经节细胞的情况下，持续去极化，这个充满神经生物素的神经节细胞图显示了典型的 M1 分层、固有光敏性视网膜神经节细胞的形态。全细胞记录后免疫组化允许树突形态与视网膜神经节细胞的电生理反应相关。在尝试此程序时，重要的是要记住要使视网膜充分充氧并快速灌注组织，以保持突触反应。

感谢您观看此演示。